补肾中药诱导小鼠胚胎干细胞向生殖细胞方向分化的研究

摘要

【目的】
　　研究补肾中药单体及复方含药鼠血清诱导小鼠胚胎干细胞定向分化为卵母细胞的影响。
　　【方法】
　　1、实验一补肾中药单体齐墩果酸对mESC定向诱导的方法
　　选择R1/E、1B10和D3三种不同小鼠品系小鼠胚胎干细胞（mESC）为实验对象，诱导mESC形成拟胚体（EB），以终浓度齐墩果酸分别干预三组EB分化，维甲酸为阳性对照组，二甲基亚砜为空白对照组，于37℃、5％ CO2条件下培养，镜下观察细胞形态学变化。3d后提取细胞RNA，合成cDNA，利用实时定量基因扩增荧光法（qPCR）检测三种细胞各组生殖分化相关的基因Oct4、Gdf9、Scp3、Mvh、Zp1、Zp2、Zp3表达水平的变化；
　　2、实验二补肾中药复方含药血清对mESC定向诱导的方法
　　选择1B10为实验对象，诱导mESC形成EB，以终浓度5%1＃、2＃、3＃、5＃、10＃含药血清干预EB，以5%空白血清作为对照，以control组（即无血清添加）为空白对照。于37℃、5% CO2条件下培养，每3天换液，收集各组细胞，镜下观察细胞形态学改变。镜下观察mESC形态变化时行细胞免疫荧光实验，验证含药鼠血清干预后的细胞是否具有GDF9、SCP3、ZP3三种卵母细胞标识蛋白的表达；利用qPCR检测定量观察含药鼠血清干预后第3、5、8、11天细胞内基因Oct4、Nanog、Prdm14、Blimp1、Tfap2c、Gdf9、Scp3、Zp3的表达；同时运用双抗体免疫酶联反应法（ELISA）测定含药鼠血清干预后每5、8、11、14天细胞内生殖细胞标志物GDF9、SCP3、ZP3含量的变化。
　　以上实验数据均使用SPSS17.0统计软件处理，若数据满足正态分布及方差齐性，则采用_x±s表示，运用卡方检验进行检测。
　　【结果】
　　1、实验一结果
　　与DMSO组相比较，齐墩果酸单体可上调R1/E中Scp3、Mvh、Zp1、Zp2基因表达（P＜0.01），上调1B10中Gdf9、Mvh、Zp2、Zp3基因表达（P＜0.05）以及D3中Oct4、Gdf9、Scp3、Mvh、Zp1、Zp3基因表达（P＜0.05），促使R1/E、1B10及D3向生殖细胞方向分化；与DMSO组相比较，阳性参照物维甲酸单体仅能上调R1/E中Mvh基因表达（P＜0.01）以及1B10中Gdf9、Mvh、Zp3基因表达（P＜0.01），而D3中各生殖基因表达均明显下调。
　　2、实验二结果
　　2.1五组含药血清组，空白血清组及control组镜下观察均可见分化后的mESC出现卵母细胞样形态学改变；
　　2.2各补肾中药含药鼠血清干预EB后，类卵细胞均能表达卵母细胞标志物GDF9、ZP3及减数分裂标志物SCP3，而空白血清组和control组则未能表达；
　　2.3五组含药血清组均与空白血清组相比较，1＃含药鼠血清干预EB后，在分化3d时Prdm14、Blimp1、Tfap2c、Scp3基因表达明显上调（P＜0.01）；3＃、5＃、10＃含药鼠血清组于分化5-8d时Gdf9、Scp3、Zp3基因表达上调（P＜0.05）进入分化活跃期；2＃含药鼠血清在分化8d时各基因表达上调并出现峰值，可显著促进基因Prdm14、Blimp1、Gdf9、Scp3表达上调（P＜0.01），五组含药血清组均随干预时间延长而各基因表达不同程度下降；
　　2.4与空白血清组相比较，不同时间段对细胞内GDF9、SCP3、ZP3的蛋白含量测定显示，除2＃含药血清组于5d时细胞内GDF9蛋白含量减少（P＜0.05）；1＃含药血清组于8d，2＃含药血清组于8、11、14d时细胞内 SCP3含量减少（P＜0.01）；3＃含药血清组全程，5＃含药血清组于14d时细胞内ZP3蛋白含量增加（P＜0.01）外，余各组三种蛋白含量均无显著差异。
　　【结论】
　　1、补肾中药单体及复方含药血清均可定向诱导mESC向早期卵母细胞方向分化。
　　2、齐墩果酸单体定向诱导起效迅速但细胞凋亡较快，不适宜长期体外干预；补肾中药含药鼠血清起效较缓但作用稳定，更具有临床意义。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

主要英文缩略词表

引言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2.实验结果

2.1 含药血清/齐墩果酸干预前mESC与EB形态学情况

2.2 实验一 补肾中药单体齐墩果酸实验结果

2.3 实验二 补肾中药复方含药血清实验结果

3. 讨论

3.1 肾精与干细胞

3.2 补肾中药单体齐墩果酸与胚胎干细胞

3.3 补肾中药复方与胚胎干细胞的分化

3.4 胚胎干细胞分化机制初探

结论

创新性评价、问题及展望

创新性评价

问题与展望

致谢

参考文献

文献综述

附件一 图片资料

附件二 在读期间公开发表的学术论文

声明