红花品质主效环境因子确定及机理初探

摘要

红花又名红蓝花，来源于菊科植物Carthamus tinctorius L.的干燥花，具通经活血、散瘀止痛之效。红花于西汉年间由张骞引入我国，主要作为染料，后作为油料作物种植；东汉始入药，逐渐发展为通经活血散瘀之要药。因其适应性较强，各地大量引种栽培，逐步形成以四川简阳、河南封丘等为主的药用红花道地产区；但目前新疆逐渐发展为主产地，产地发生变化。四川、河南、新疆等地的气候类型迥异，环境因子存在显著差异，而植物次生代谢产物的合成与累积往往与所处环境有关，其对红花有效成分的种类和含量有极大影响，光照、温度、水分和土壤等因子相互联系、相互制约，综合影响红花的生长和质量。
　　本研究对不同产地的红花资源进行调查，检测有效成分含量及颜色的三色度值，并进行主成分及关联性分析，从有效成分含量和性状方面评价不同产地红花药材的质量；同时基于Maxent模型预测适宜红花分布的环境因子，进行光照和土壤养分胁迫处理，记录红花生长情况（株高及生物量），检测有效成分和植物内源激素含量，探究“环境胁迫-成分积累”的内在关联机理，为红花有效成分积累的分子机制及其道地产区的形成和变迁的研究奠定理论基础。结果如下：
　　1.红花资源调查和遗传多态性分析
　　通过红花资源调查，近年来红花主产地发生变化，新疆维吾尔自治区由于气候与土壤条件适宜、地形宽广，全国约90%的药用红花均产自新疆，其次为云南、甘肃等地。各产地红花种质资源混乱，存在多产地互相引种现象，例如新疆多引种于云南；此外，各品种间互相杂交，使红花质量良莠不齐，性状也存在差异。
　　实验室收集不同产地的25批红花样品，对其进行ITS序列比对，只存在两处变异，各样品间无明显差异，说明无法利用ITS序列区分各红花种质间的遗传差异。筛选红花SSR引物并进行PCR扩增，利用NTSYS-pc2.1软件计算Nei’s遗传距离，在0.0000~0.6405之间变动；利用UPGMA法将其聚为两个类群：第一大类包括新疆乌鲁木齐、伊犁，甘肃，云南和内蒙，其中新疆吉木萨尔、塔城裕民和云南巍山县的相似系数为1，可认为三个样品间无遗传差异；第二大类主要集中在新疆伊犁霍城县和塔城裕民县各地。从进化树的整体情况来看，25批红花样品之间存在差异，但多态性不高。此外，两大类中的红花样品在性状上并无明显规律，其遗传与表型之间不存在显著关联性。
　　通过资源调查及遗传多态性分析，不同产地红花样品的遗传多态性不高，差异不明显，其原因可能是大部分种质均来自于云南，而各产地迥异的环境因子导致了红花性状上的差异。因此，本研究利用同一批种子筛选环境因子可排除种质遗传变异的干扰，环境因子是影响红花性状及其有效成分含量的主要原因。
　　2.红花品质评价
　　利用HPLC检测红花样品中羟基红花黄色素A、槲皮素、柚皮素和山柰酚的含量，并进行主成分分析。其中，内蒙与云南的红花样品中4种黄酮类成分含量较高，其次主要集中于新疆塔城地区；新疆伊犁霍城县及察布查尔县的部分红花样品黄酮类成分含量较低。依据黄酮类成分含量可将不同产地红花样品聚为两类：第一类主要包括新疆乌鲁木齐与塔城大部分地区、甘肃、云南、内蒙；第二大类集中于新疆伊犁大部分地区，该结果与遗传多态性的聚类结果基本相同。
　　利用SPSS17.0对红花样品中4种黄酮类成分和红花粉末、25%甲醇提取液、HCl水解液的色度值进行关联性分析，三者的色度值均可用来反映 HSYA与柚皮素的含量，但无法直观反映槲皮素和山柰酚的含量，由于测定粉末颜色操作简单，且能反映红花总体性状，故将其三色度值作为评价红花药材质量的指标；颜色鲜亮且红丝较多的红花其 HSYA的含量越大，而颜色偏黄色的红花其柚皮素含量越大。
　　将32批红花样品依据花色大致可分为三组，大部分样品属于第二组。其中，属于第一组的XJ-18（新疆伊犁察布查尔县）样品中有效成分含量并不高；而有效成分含量较高的HHC-JY-1（荷花池简阳）样品却属于第三组。说明传统经验鉴别无法客观量化红花药材质量；而花色偏红的红花中HSYA含量较大，其L*、a*值也大；花色偏黄的红花b*值大，柚皮素含量亦高。因此，根据色度值大小间接判断红花药材质量好坏的方法可避免主观评价的不确定性，为红花质量评价提供量化标准。
　　3.影响红花分布及质量的环境因子分析
　　最大熵模型（maximum entropy，Maxent）是以最大熵理论为理论基础，综合气候、海拔、土壤等因素，估计密度、预测物种分布的一种模型。经预测得到光照与温度是影响红花生长和分布的主要生态因子，其 AUC值为0.996，预测效果非常好。
　　红花花期包括初花期和盛花期（6~7月），选取红花主产地6~7月气候因子（包括降水量、蒸发量、平均最低温度、平均最高温度、平均温度、日照时数和相对湿度）的相关数据，将其分别与黄酮类成分含量、三色度值进行相关性分析后可得：降水量、平均最低温度和日照时数均可显著影响花期红花的有效成分累积。
　　记录环境胁迫红花的生长情况，计算株高差与平均生物量，发现光照时间过短和遮光处理均会影响红花的生长及开花情况，且浓度过高的氮、磷肥能抑制其生长。有效成分含量的主成分分析结果表明：光照时间过短或进行遮光处理会减少4种黄酮类成分的含量；过高浓度的氮、磷肥不利于有效成分的累积，而中等浓度的氮、磷、钾肥处理可增大其含量。红花生长及有效成分含量的分析均表明：光照与土壤养分均可影响红花质量，光照时间越长，光照强度越大，其生物量越多，有效成分含量也越大；氮、磷肥的浓度不宜过大，中等浓度的氮、磷、钾肥能显著增加红花生物量，有利于黄酮类成分的累积。
　　总而言之，光照能显著影响红花的生长、分布及有效成分含量的累积。红花属长日照植物，而新疆属温带大陆性气候，年均日照时数可达3000h，且地形平坦，多平原，利于红花的规模种植，这可能是目前红花主产地变迁的主要原因。
　　4.环境因子作用机理分析
　　植物内源激素含量与株高差、平均生物量和有效成分含量的相关性分析结果表明：激素含量可调控红花中的山柰酚含量、株高和生物量。GA3与IAA为生长素，能控制植物的分化、伸长、开花等生理过程，可显著影响山柰酚的累积；ABA作为逆境激素，能调节气孔关闭和茎的生长等，含量越多，红花平均生物量越大；而 ZT则能抑制顶端优势，促进侧芽生长，其含量与株高差显著相关，含量越大，红花植株越高。
　　通过分析可知：光照与土壤养分均可显著影响红花中各植物内源激素的含量，而激素含量与株高差、平均生物量、有效成分含量显著相关。因此，光照与土壤养分能通过影响植物内源激素的含量来调控自身生长及其有效成分含量的累积。

目录

第一章 前言

第二章 红花样品收集及遗传多态性分析

2.1 红花样品收集

2.2红花遗传多态性分析

2.3 小结

第三章 不同产地红花的品质评价

3.1红花黄酮类成分含量测定

3.2 红花颜色测定

3.3 结果分析

3.4 小结

第四章 基于Maxent模型的主导生态因子筛选及红花环境胁迫

4.1基于Maxent模型的主导生态因子筛选

4.2 环境胁迫

4.3 黄酮类成分含量测定

4.4 红花植物激素含量测定

4.5 结果分析

4.6 小结

第五章 总结与展望

5.1 红花遗传多态性分析

5.2 红花品质评价

5.3 影响红花分布及质量的环境因子

5.4 环境因子作用机理探究

5.5 展望

综述

参考文献

致谢

在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

声明

附录一

附录二