针刺治疗慢性疲劳综合征临床效应与调节microRNA的相关性研究

摘要

目的：
　　1.通过高通量测序筛选CFS患者与健康者的差异循环miRNA，探索与CFS发生发展可能相关的miRNA。
　　2.探索针刺治疗CFS的临床效应与调节miRNA表达的相关性。
　　方法：
　　1.采用高通量测序技术检测15例CFS患者的循环miRNA，与8例健康者对照，绘制循环miRNA差异表达谱，依据差异倍数高、表达稳定的原则，筛选出差异表达最为显著的4个miRNA，并对测序结果进行RT-qPCR验证；采用RNAhybrid、miRanda和 TargetScan预测差异 miRNA的靶基因，基于 Gene Ontology数据库进行GO显著性富集分析，初步明确相关靶基因功能类；以KEGG Pathway为单位进行Pathway显著性富集度分析，初步明确相关靶基因生物学路径。
　　2.采用随机对照临床试验方法，将15例CFS患者随机分为针刺组（A组，8例）和安慰针刺组（B组，7例）。A组针刺百会、神门、肝俞、脾俞、肾俞和足三里，B组采用Streitberger套针假针刺6个非经非穴，两组分别按不同的针刺方案治疗4周，前两周治疗5次/周，后两周治疗3次/周，共16次。评价两组入组0周、4周Chalder疲劳量表、SPHERE量表评分。同时，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法，检测A、B两组患者入组4周后3个循环miRNA的表达，并通过相关性分析探索针刺治疗CFS临床效应与调节miRNA的相关性。
　　结果：
　　1. CFS患者循环miRNA表达的高通量筛选结果：与健康受试者相比，CFS患者外周血中显著差异表达的miRNA有84个（差异倍数≥2，校正P值≤0.1），其中48个上调，36个miRNA下调，差异最为显著的4个miRNA是novel_mir122、novel_mir347、hsa-miR-200a-3P和hsa-miR-1-3P；RT-qPCR验证结果显示，CFS中hsa-miR-1-3P表达显著降低（P＜0.05），novel_mir122和novel_mir347表达显著升高（P＜0.05），与高通量测序结果一致。预测显著差异的miRNA相关靶基因共16087个，结合相应的过滤条件如自由能、得分值等进行过滤后得到9575个，其中3个miRNA靶基因共90个；3个miRNA靶基因功能主要富集在生物过程中的细胞进程、单个有机体发育进程和代谢进程等，细胞成分中细胞、细胞部分和细胞周边等部分的生物功能及分子功能中结合、催化活性和分子传导活性、蛋白激酶活性等功能（Q＜0.1）；3个miRNA靶基因显著富集于30条通路，包括MAPK信号途径、钙信号通路、cAMP信号转导途径和Wnt信号途径等信号转导通路，醛固酮合成和分泌、肾素分泌和促性腺激素信号途径等内分泌系统相关通路，自然杀伤细胞介导细胞毒性等免疫系统相关通路，以及磷酸戊糖途径、嘌呤代谢途径等代谢相关通路（P＜0.05）。
　　2.针刺治疗CFS患者临床效应及循环miRNA的相关性研究结果：（1）治疗4周后，A组Chalder疲劳量表总评分及各维度评分和SPHERE量表评分均显著低于B组，差异有统计学意义（均P＜0.05）；（2）治疗4周后，与B组相比，A组hsa-miR-1-3P表达显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05），novel_mir122表达显著下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；（3）在基线期hsa-miR-1-3P表达与Chalder疲劳量表评分呈中等程度负相关（P＜0.05），novel_mir122表达与Chalder疲劳量表评分呈中等程度正相关（P＜0.05），novel_mir347表达与Chalder疲劳量表心理维度评分呈强度正相关（P＜0.05）；治疗4周后，与B组相比， A组Chalder疲劳量表和Chalder疲劳量表心理维度评分的降低与novel_mir122表达量下调呈正相关（均P＜0.05）。
　　结论：
　　1. CFS患者外周血中存在异常表达的miRNA，这些miRNA的异常表达可能调节免疫炎症、氧化与硝化应激和能量代谢等相关信号通路，调控CFS的发生发展进程。
　　2.针刺治疗可有效缓解CFS患者疲劳程度，减少感觉紧张或者焦虑以及注意力不集中等心理症状，这种效应可能与针刺下调novel_mir122表达，调控CFS患者免疫炎症、氧化与硝化应激和能量代谢等相关信号通路有关。

目录

中英文缩略词表

引言

第一部分 CFS发生发展相关的miRNA高通量筛选

1. 研究对象

2. 研究试剂与仪器

3. 研究方法

4. 研究结果

第二部分 针刺治疗CFS临床效应及调节miRNA的相关性

1. 研究对象

2. 研究材料、试剂与仪器

3. 研究方法

4. 研究结果

讨论

1. 现代医学对CFS的认识

2. 中医对CFS的认识和治疗

3. 针刺治疗CFS临床效应与调节miRNA的相关性

结论

特色与创新

问题与展望

1. 本研究存在的不足

2. 今后研究工作的展望

致谢

参考文献

附件一:综述：针灸治疗慢性疲劳综合征的表观遗传学机制探讨

附件二

附件三

声明