内质网应激-自噬途径在胰岛β细胞脂毒性损伤中的作用及机制探讨

摘要

脂毒性在肥胖相关2型糖尿病的发病机制中发挥重要作用。脂毒性不仅引起胰岛外周组织的胰岛素抵抗,还会给胰岛β细胞带来损伤。β细胞在脂毒性损伤过程中的病理生理变化仍未完全阐明。研究表明,自噬对于β细胞数量、结构和功能等的维持至关重要,而内质网应激则是参与介导β细胞功能损伤的重要因素,研究脂毒性与二者的关系有助于深入认识脂毒性过程。实验以小鼠胰岛细胞瘤MIN6细胞系为模型,通过药理学手段干预,探讨β细胞内是否存在由内质网应激引起的自噬,以及该可能途径在β细胞脂毒性损伤中的作用及相关机制。
　　1.胰岛β细胞内的内质网应激-自噬途径及其调控机制
　　内质网应激诱导剂Thapsigargin(TG)对MIN6细胞的毒性作用具有剂量依赖性,0.1μM或1μMTG处理36h抑制细胞活力且不利于细胞维持正常形态。0.1μMTG处理MIN6细胞36h,自噬标志蛋白LC3II表达增加,同时,透射电镜观察发现,细胞内自噬结构明显增加。TG处理不同时间,胰岛素诱导的Akt在Ser473位点的磷酸化逐渐被抑制,但胰岛素受体β(IRβ)的表达未受影响。50μMPI3K抑制剂LY294002增加TG诱导的LC3II表达。随TG处理时间延长,JNK磷酸化水平增加,20μMJNK抑制剂SP600125抑制TG诱导的LC3II表达。相对于单独TG组,5mM自噬抑制剂3-MA预处理1h,进一步增加TG对细胞活力的抑制(P<0.01)以及凋亡比例,糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)水平进一步下降(P<0.01)。
　　2.棕榈酸诱导的β细胞自噬及其与内质网应激关系的研究
　　棕榈酸(PA)呈剂量和时间依赖性抑制MIN6细胞活力。0.5mMPA处理24h或36h,BIS(P<0.01)和GSIS(P<0.01)减少。PA处理36h,LC3II表达增加。PA处理后,BiP、CHOP以及p-JNK表达呈增加趋势。500μM内质网应激抑制剂TUDCA或20μMSP600125一定程度抑制PA诱导的LC3II表达增加。3-MA预处理使PA引起的凋亡增加,而TUDCA或自噬诱导剂Rapamycin(50nM)使凋亡减少。油红染色显示,PA处理使细胞内脂质增加。PA逐渐抑制Akt的丝氨酸磷酸化,但未引起IRβ表达下降。50μMLY294002使PA诱导的LC3II表达进一步增加。TUDCA或SP600125可减轻PA对Akt丝氨酸磷酸化的抑制。TUDCA或Rapamycin改善PA引起的细胞活力抑制(P<0.05)以及GSIS水平下降(分别P<0.01,P<0.05)。3-MA预处理使BiP、CHOP的表达较PA单独组明显增加。
　　结论:1)胰岛β细胞内存在内质网应激-自噬途径;2)棕榈酸诱导的自噬与内质网应激、JNK通路活化以及胰岛素信号通路的抑制有关;3)抑制自噬加重脂毒性所致β细胞内质网应激及相关细胞损伤;4)抑制内质网应激或增强自噬是保护β细胞免受脂毒性损伤的可能途径。

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前言

研究内容第一部分 胰岛β细胞内的内质网应激-自噬途径及其调控机制

1 材料

1.1 细胞

1.2主要试剂

1.3 主要仪器设备

2 方法

2.1 细胞培养

2.2 细胞活力检测

2.3 内质网应激对MIN6细胞形态的影响

2.4 Western Blot检测蛋白表达

2.5 自噬超微结构观察

2.6 胰岛素释放试验

2.7 H oechst 33258染色

2.8 统计学分析

3 结果

3.1 内质网应激对β细胞活力及形态的影响

3.2β细胞内存在内质网应激-自噬途径

3.3 透射电子显微镜观察自噬超微结构

3.4 内质网应激通过抑制Akt蛋白磷酸化诱导β细胞自噬

3.5 内质网应激通过JNK通路调控自噬

3.6 抑制自噬增加内质网应激所致β细胞损害

4 讨论

第二部分 棕榈酸诱导的 细胞自噬及其与内质网β应激关系的研究

1 材料

1.1 细胞系

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器设备

2 方法

2.1 药物配制

2.2 棕榈酸对MIN6细胞活力的影响

2.3 棕榈酸对MIN6细胞胰岛素分泌的影响

2.4 油红O染色

2.5 干预内质网应激或自噬对MIN6细胞脂性凋亡的影响

2.6 Western Blot检测蛋白表达

2.7 干预内质网应激或自噬对脂毒性条件下MIN6细胞活力的影响

2.8 干预内质网应激或自噬对脂毒性条件下MIN6细胞胰岛素分泌的影响

3 结果

3.1 棕榈酸对体外培养β细胞的脂毒性损伤作用

3.2 棕榈酸通过内质网应激及JNK通路诱导β细胞自噬

3.3内质网应激和自噬在对β细胞脂性凋亡的影响

3.4 棕榈酸致体外培养的β细胞内出现脂质堆积

3.5 内质网应激和JNK通路通过下调Akt磷酸化介导棕榈酸诱导的自噬

3.6 干预内质网应激或自噬对β细胞脂毒性损伤的影响

3.7 抑制自噬加重棕榈酸诱导的内质网应激

4 讨论

结论

参考文献

文献综述一内质网应激、JNK通路与胰岛β细胞

参考文献

文献综述二自噬与2型糖尿病

参考文献

附录

攻读学位期间发表文章情况

致谢