高迁移率族蛋白1在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达及作用机制

摘要

慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP)是鼻腔和鼻窦黏膜的慢性炎症性病变,通常与感染(病毒、细菌、真菌等)、变态反应和粘液纤毛传输功能障碍等多种因素共同作用的结果。组织形态学特点表现为上皮细胞损伤,炎性细胞浸润和上皮下层水肿。广义而言,炎症是一种机体对感染和损伤的自我保护机制,而炎性细胞的长期浸润,且不断释放的炎性介质和细胞因子(如IL-5、IL-8、TNF-α、IFN-γ和RANTES等)相互作用,促进鼻黏膜局部炎症反应不断循环扩大。
　　近年来,研究发现新的“晚期炎性因子”高迁移率族蛋白1(High mobility group box 1,HMGB1)在炎症网络中的起到关键作用,它可以直接作用于各种炎性细胞(包括中性粒细胞和嗜酸性粒细胞),诱导其释放多种促炎性或炎性介质,启动机体的天然和获得性免疫过程。已有研究表明,HMGB1在COPD患者的呼吸道上皮细胞中和变应性鼻炎患者的鼻腔分泌物中过表达,但是作用机制尚未被阐述。本研究,我们拟用免疫组化、Western blot、RT-PCR等实验方法探讨HMGB1在CRSwNP中的作用和意义,加深我们对CRSwNP发病机制的认识,为CRSwNP的治疗提供新的实验和理论依据。
　　第一部分HMGB1在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达及意义
　　目的:研究HMGB1在慢性鼻窦炎伴鼻息肉及正常鼻黏膜中的表达水平,以探讨其在鼻息肉形成过程中发挥的作用。
　　方法:对41例鼻息肉组织及9例正常鼻黏膜组织分别进行免疫组化、Western blot和RT-PCR法检测HMGB1、IL-5、IL-8、TNF-α及其mRNA水平。
　　结果:
　　1.免疫组化显示HMGB1蛋白在嗜酸性粒细胞性和非嗜酸性粒细胞性鼻息肉均较正常对照组高;
　　2.Western blot显示HMGB1蛋白水平在嗜酸性粒细胞性鼻息肉明显高于正常对照组和非嗜酸性粒细胞性鼻息肉(P值分别为0.044,0.001);
　　3.HMGB1 mRNA,IL5,IL8和TNF-αmRNA在嗜酸性粒细胞性鼻息肉中表达上调,但在非嗜酸性粒细胞性鼻息肉和正常对照组中相似;
　　4.HMGB1 mRNA与IL5,IL8,TNF-αmRNA存在正相关性(rs分别为0.665,0.771,0.724;P值均<0.001);
　　5.HMGB1 mRNA与组织浸润嗜酸性粒细胞和血嗜酸性粒细胞存在较弱的正相关性(rs分别为0.149,0.225;P值分别为0.012,0.001)。
　　结论:HMGB1蛋白可能参与了慢性鼻窦炎伴鼻息肉的炎性反应过程,并与不同亚型相关,可作为指导慢性鼻窦炎伴鼻息肉的治疗和评价疗效的潜在指标。
　　第二部分脂多糖对人鼻黏膜上皮细胞HMGB1表达的影响及意义
　　目的:观察脂多糖诱导原代培养的鼻黏膜上皮细胞HMGB1蛋白的表达、移位和释放的影响。
　　方法:以不同浓度的脂多糖(lipopolysaacharides,LPS)作用于原代培养的鼻息肉上皮细胞,检测其对上皮细胞HMGB1的表达及释放情况。分别于0、12、24、48、72h用免疫荧光法观察细胞中HMGB1的定位和移位,WesternBlot检测细胞中HMGB1蛋白变化趋势。
　　结果:与对照组比较,LPS诱导原代培养的鼻息肉上皮细胞24h后,免疫荧光法显示HMGB1蛋白从胞核向胞浆移位,并随着刺激时间的延长胞质中HMGB1的表达逐渐增加;在时间依赖性实验中,100μg/ml LPS刺激上皮细胞24h、48h、72h后,细胞HMGB1蛋白增加(P<0.05);刺激48h、72h后培养上清中HMGB1明显升高(P<0.01)。
　　结论:LPS可以诱导原代培养的鼻黏膜上皮细胞HMGB1的移位和释放,提示HMGB1蛋白在慢性鼻窦炎伴鼻息肉的形成和发展过程中起到一定的作用。

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参考文献

第一部分 HMGB1在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达及意义

一．材料

1、研究对象

2 标本采集与处理

3. 实验仪器及设备

4．主要试剂及配制

二．实验方法

1．临床资料分析方法

2. H.E染色

3. 免疫组织化学，采用EnVision二步法

4. RT-PCR

5. Western blot

三．统计分析

四．结 果

1．慢性鼻窦炎伴鼻息肉和正常鼻黏膜的临床特点

2. 组织形态特点

3．免疫组化检测HMGB1, IL-5, IL-8, 和 TNF-α蛋白的表达

4．RT-PCR检测HMGB1, IL-5, IL-8, 和 TNF-αmRNA的水平

5. HMGB1 mRNA与IL-5 mRNA, IL-8 mRNA, TNF-αmRNA和嗜酸性粒细胞的相关性

6. Western blot检测HMGB1蛋白的表达

五．讨 论

参考文献

第二部分 脂多糖对人鼻黏膜上皮细胞HMGB1的影响及意义

一．材料

1. 标本

2. 实验仪器及设备

3. 主要试剂及配制

二．实验方法

1．人鼻黏膜上皮细胞原代分离、培养

2．台盼蓝检测细胞活力

3．LPS诱导原代培养的人鼻黏膜上皮细胞

4．免疫荧光染色

5．Western Blot

三．统计分析

四．结 果

1. 人鼻黏膜上皮细胞培养及形态观察

2. HMGB1在LPS刺激鼻黏膜上皮细胞时的表达定位

3．LPS对鼻黏膜上皮细胞HMGB1蛋白表达水平的影响

4．细胞培养上清HMGB1的检测

五．讨 论

参考文献

综 述

硕士在读期间发表及已完成的论文

致 谢