PTC124治疗弹性纤维假黄瘤的初步研究

摘要

研究背景与目的:
　　弹性纤维假黄瘤(Pseudoxanthoma elasticum,PXE),是一种少见的常染色体遗传性疾病,由16号染色体上的ABCC6基因突变引起的,主要累及弹性纤维和结缔组织,造成弹力纤维降解及组织钙化变硬,可侵犯人体多个器官和系统,主要表现为皮肤、眼、心血管系统损害,发病率约为1:50000。迄今为止,共发现ABCC6基因突变近600个。无义突变(nonsense mutation)是指由于某个碱基的改变,使代某种氨基酸的密码子突变为终止密码子,从而使肽链合成提前终止,肽链合成中断。PXE患者中无义突变的比例近40％,其中R1141X占30%,是主要的致病原因之一,目前缺乏有效的治疗手段。
　　PTC124(Ataluren),是PTCTherapeutics公司生产的小分子药剂,主要通过降低核糖体对早熟终止密码子(Premature Terminationcodon,PTC)的敏感性,或忽略早熟终止密码子,从而实现对早熟终止密码子的通读(Read-through)。目前PTC124已经应用在治疗遗传性疾病的临床试验中,其中囊性纤维化(Cystic Fibrosis)已经进入III期临床试验。
　　本实验通过体外研究,观察PTC124对PXE患者早熟终止密码子的通读作用,为临床治疗提供新的思路和办法。
　　研究方法:
　　1.体外实验以人HEK293细胞为研究模型
　　在PCMV6-hABCC6-DDK质粒中建立已知的7种不同的早熟终止密码子突变模型,转染至HEK293细胞,PTC124处理72小时,免异荧光染色法和细胞内ELISA法检测早熟终止密码子的通读效率。
　　2.体内实验以斑马鱼为研究模型
　　R1141X是最常见的无义突变,占35%,根据R1141X早熟终止密码子通读后变化的氨基酸序列,在BS/SK-hABCC6质粒中,构建3种可能的错义突变模型,生成相应的mRNA,显微注射入斑马鱼胚胎进行拯救分析实验,观察斑马鱼胚胎的存活率而分析各种错义突变的作用。
　　结果:
　　1.体外实验以人HEK293细胞为研究模型实验结果
　　①PTC124浓度在0-40umol/L时无细胞毒性。②对7种无义突变,PTC124可以提高早熟终止密码子的通读效率,浓度在5umol/L时通读效率最高。③PTC124浓度在5umol/L时,R1164X and R1275X的通读效率最高,<8%。④早熟终止密码子的通读效率不仅受药物浓度影响,还受早熟终止密码子后一位氨基酸序列影响,且当+1位置的序列为“C”时最高。
　　2.体内实验以斑马鱼为研究模型实验结果
　　①早熟终止密码子通读后3种可能的错义突变模型,生成相应的mRNA,可以使斑马鱼胚胎正常发育,存活率分别为WT90.6%,TGG73.4%,TGC92.5%,GGA84%,阳性对照组(注射morpholino、R1141X)存活率29%,阴性对照组(注射standard control morpholino)存活率88%,治疗组与mopholino对照组之间有显著性差异(p<0.05)。②3种错义突变模型之间和突变模型与阴性对照组,斑马鱼胚胎存活率无显著性差异(p>0.05)。
　　结论:
　　1.PTC124可以提高早熟终止密码子的通读效率,浓度在5ug/mL时通读效率最高;
　　2.早熟终止密码子的通读效率不仅受药物浓度影响,还受早熟终止密码子后一位氨基酸序列影响,且当+1位置的序列为“C”时最高;
　　3.早熟终止密码子通读后3种可能的错义突变,生成相应的mRNA,可以使斑马鱼胚胎正常发育,存活率与对morpholino照组组之间有显著性差异(p<0.05)。
　　4.PTC124对弹性纤维假黄瘤患者有潜在的治疗作用,需要进一步研究。

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英文摘要

PTC124治疗弹性纤维假黄瘤的初步研究

前言

参考文献

第一部分PTC124对弹性纤维假黄瘤（PXE）无义突变的通读作用

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

三、统计学分析

结果

一、PTC124对HEK293细胞毒性的检测

二、免疫荧光染色

三、PTC124处理后，ABCC6蛋白在WT和各突变型中的表达

讨 论

一、ABCC6基因及其在PXE发病的作用

二、PTC124的药理学特点及其应用

三、PTC124对早熟终止密码子的通读作用

结论

参考文献

第二部分 斑马鱼胚胎发育系统检测ABCC6多肽链功能的研究

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

三、斑马鱼胚胎显微注射

四、统计学分析

结 果

一、Morpholino和突变型p.R1141X对斑马鱼胚胎存活的影响

二、Morpholino和突变型p.R1141X对斑马鱼胚胎发育的影响

讨 论

一、Morpholino和斑马鱼研究技术

二、新的斑马鱼系统检测ABCC6肽链功能

参考文献

全文总结

文献综述

攻读学位期间发表文章情况

致 谢