靶向MUC1蛋白细胞毒性T细胞在胃癌治疗中的实验研究

摘要

研究背景:过继性细胞免疫治疗已成为抗肿瘤综合治疗的重要组成部分,如何提高免疫细胞的特异性及抗肿瘤疗效已成为备受关注的问题之一。肿瘤相关抗原是特异性免疫治疗的基础。MUC1蛋白(MUC1)是近年来发现的肿瘤相关抗原之一,在几乎所有上皮类腺癌细胞中都有表达,能诱导特异性细胞免疫和体液免疫,是肿瘤免疫治疗的理想靶点。目前MUC1在免疫治疗中的研究多集中于肺癌、乳腺癌、肾癌及胰腺癌等,而在胃癌免疫治疗中鲜有报道。研究表明MUC1在胃癌中表达水平升高,但其能否诱导细胞免疫产生特异性细胞毒性T细胞(CTL细胞)未见相关研究。检测并制备这种特异性CTL细胞在胃癌免疫治疗中有重要的临床价值。利用MHC-肽四聚体的流式细胞检测法是定量检测特异性CTL细胞的金标准,而最新应用的MHC-肽五聚体具有更高的敏感性和特异性,是检测特异性CTL的理想方法。另一方面目前常用于制备特异性T细胞的肿瘤抗原包括:蛋白多肽、核酸、全肿瘤细胞抗原等。研究表明利用蛋白多肽等制备的免疫细胞具有较好的靶向性,但因针对单一肿瘤抗原表位容易发生免疫逃逸。而全肿瘤细胞抗原可诱导靶向多种抗原的T细胞克隆,保证了抗肿瘤免疫的全面性,但其靶向特定抗原表位的特异性T细胞比例较低。因此联合应用全肿瘤细胞抗原和蛋白多肽有可能在保证抗肿瘤免疫全面性基础上提高免疫细胞的特异性抗肿瘤能力,获得更好的抗肿瘤疗效。
　　研究目的:建立胃癌患者外周血特异性T细胞的检测方法,评估胃癌患者预存免疫状态;制备具有全面抗肿瘤效应同时靶向MUC1蛋白的CTL细胞,评价其抗肿瘤疗效。
　　方法:1)利用MUC1试剂盒和全自动电化学发光免疫分析仪检测胃癌患者外周血MUC1的表达;利用HLA-A2流式抗体筛选阳性个体,HLA-A*0201/MUC1五聚体检测胃癌患者外周血MUC1特异性T细胞比例;以CD45RO+CD62L+为流式标记检测中央型记忆性T细胞(TCM细胞)比例;以CD3+CD4+CD25+FOXP3+为流式标记检测调节性T细胞(Treg细胞)比例,并与健康人比较差异。2)利用HLA-A2抗体和Elisa法筛选高表达MUC1及HLA-A2阳性的胃癌细胞系;利用胃癌KATO-Ⅲ细胞全细胞裂解产物为抗原,分别用甘露多聚糖肽和绿脓杆菌鞭毛制剂(佰安)为免疫佐剂制备DC细胞,检测CD80、CD86、CD83及HLA-DR细胞表型,比较甘露多聚糖肽和佰安对DC细胞成熟剂抗原提呈能力的作用;分别利用胃癌KATO-Ⅲ细胞全细胞抗原和两种MUC1抗原肽致敏DC细胞诱导不同CTL细胞,检测MUC1特异性T细胞,TCM细胞,CD38+HLA-DR+T细胞和Treg细胞比例,筛选CTL细胞。3)利用胃癌KATO-Ⅲ细胞建立体外平面肿瘤模型和立体肿瘤模型,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测不同CTL细胞的杀伤活性;以胃癌KATO-Ⅲ细胞制备裸鼠皮下肿瘤模型,通过尾静脉注射将CTL细胞回输体内,比较联合全肿瘤细胞抗原和MUC1抗原肽制备的CTL细胞与常规方法(全肿瘤细胞裂解抗原)制备的CTL细胞抗肿瘤疗效。
　　结果:1)胃癌患者外周血MUC1表达水平,MUC1特异性T细胞比例,CD8+/CD4+TCM细胞比例,Treg细胞比例明显高于健康人,两者相比有统计学意义(P<0.05)。2)胃癌KATO-Ⅲ细胞HLA-A2阳性率为99.9％,Elisa法显示其MUC1表达量高于其他两种胃癌细胞,是适合本研究的细胞模型;以佰安为免疫佐剂制备的DC细胞的抗原提呈能力和细胞成熟度高于甘露多聚糖肽,两者之间并无统计学差异(P>0.05);利用胃癌KATO-Ⅲ细胞全细胞抗原联合两种MUC1抗原肽致敏DC细胞诱导的CTL细胞中MUC1特异性T细胞比例,CD8+/CD4+TCM细胞比例均高于其它CTL细胞,Treg细胞比例低于其它CTL细胞,且有统计学意义(P<0.05);3)利用胃癌KATO-Ⅲ细胞全细胞抗原联合MUC1抗原肽致敏DC细胞诱导的CTL细胞在平面肿瘤模型和立体肿瘤模型中对KATO-Ⅲ细胞的杀伤能力高于其它CTL细胞,且有统计学意义(P<0.05);在裸鼠皮下肿瘤模型中的肿瘤抑制率明显高于常规方法制备的CTL细胞,且有统计学意义(P<0.05)。
　　结论:1)胃癌患者外周血中存在MUC1特异性CTL细胞且其比例较健康人显著升高;2)胃癌患者体内有一定的预存抗肿瘤免疫能力,但也存在着显著的免疫抑制因素;3)利用KATO-Ⅲ全细胞抗原联合两种MUC1抗原肽制备的CTL细胞中MUC1特异性T细胞和抗肿瘤疗效优于常规制备方法。

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第一部分 胃癌患者外周血MUC1特异性T淋巴细胞的检测与预存免疫状态评估

材 料

方 法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

第二部分 靶向MUC1蛋白CTL细胞的制备与筛选

材 料

方 法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

第三部分 靶向MUC1蛋白的CTL细胞抗肿瘤能力实验

材 料

方 法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

全文小结

综 述

攻读博士期间发表的文章

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