16S rDNA分子生物学技术在除磷菌种群结构分析中的应用

摘要

本研究主要应用PCR-DGGE、PCR产物克隆等16S rDNA分子生物学技术，结合城市污水生物除磷工艺的特点，对平行AN/AO工艺活性污泥中除磷菌的种群结构进行分析。在此基础上，讨论了氧气和NO<,3><'->等不同电子受体条件对除磷菌种群结构的影响，以及氧气和NO<,3><'->等电子受体条件分别在不同pH环境下除磷菌种群结构的变化。 该方法可以不经培养，利用不同微生物16S rDNA遗传讯息的保守性和差异性对样品的种群结构以及主要菌种的种属进行讨论和鉴定。试验从活性污泥样品中提取总DNA，采用套式PCR对除磷菌的16S rDNA V3区进行扩增，结合DGGE、PCR产物克隆等技术分析环境样品中除磷菌的种群结构。通过DNA测序技术与NCBI(美国国立生物技术信息中心)基因库比对可以对部分主要除磷菌的种属进行鉴定，从而对生物除磷活性污泥中的微生物群落结构得到一个比较全面、客观的认识。 平行AN/AO工艺调试过程中，微生物多样性相当丰富且种群结构也比较复杂，对外来的环境冲击影响表现出较强的动态稳定性。污泥的内外回流不可避免的造成了微生物在不同区域中的“流动”，因此大部分除磷菌在不同功能区域中的种群结构差别不大。另检测到少数优势菌群可能是在专性厌氧/缺氧条件下生长的，属于反硝化除磷菌的功能菌群。在该工艺的运行过程中，采用套式．PCR方法，结合DGGE对活性污泥样品中放线菌(．dctinobacteria)、变形杆菌(Proteobacteria)、产酸细菌(Acidobacterium)等菌群的种群结构进行了分类讨论，结合进出水水质，在分子生物学角度证实了除磷菌在污水处理过程中明显的除磷作用。通过割胶、测序、NCBI比对初步确定了优势菌种的种属。 通过对O<,2>和NO<,3><'->等不同电子受体条件下培养驯化的活性污泥中除磷菌的群落结构进行对比分析，讨论了代谢链的差异性所造成的微生物群落结构较为明显的规律性变化，验证了培养驯化方法用于除磷菌分类筛选与富集的可行性。在此过程中，检测到在厌氧/缺氧反硝化除磷过程中的部分优势菌种，该类菌种属于“反硝化除磷菌”的功能菌群。驯化过程在6.5～8.5的pH值范围内，除磷菌的种群结构均较为相近，仅有少数菌种的细菌数量表现出较为简单的规律性变化，表明生物除磷过程中的微生态系统在此pH范围内的稳定性。结果显示，研究中所采用的16S rDNA分子生物学技术，可以对环境样品中的微生物进行快速分析，真实而完整的反映其中微生物群落结构的复杂性和多样性，且环境样品中具有的多种复杂成分对分析的影响不大。FISH、RT-PCR等分子生物学定量分析技术，将是后续研究的热点。如何将这一分析技术用于指导工程实践，是进一步深入研究的主要方向。

目录

文摘

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论文说明：资助

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第一章综述

1.1微生物在污水生物处理工艺中的重要作用

1.2分子生物学技术在环境微生物群落结构分析中的应用

1.3本研究应用的16S rDNA分子生物学分析技术

1.3.1概述

1.3.2 DNA的提取与纯化

1.3.3聚合酶链式反应(PCR)技术

1.3.4琼脂糖凝胶电泳分析技术

1.3.5变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术

1.3.6 PCR产物克隆技术

1.3.7 DNA测序及微生物分类鉴定

1.4主要研究内容和技术路线

1.4.1研究内容

1.4.2技术路线

第二章试验方法与材料

2.1试验用水与工艺概述

2.2样品的采集及预处理

2.3样品总DNA的提取及检测

2.3.1样品总DNA的提取方法

2.3.2提取总DNA的结果检测

2.4 PCR扩增

2.4.1 PCR扩增方法及反应体系

2.4.2 PCR扩增引物及程序

2.4.3 PCR扩增试剂

2.4.4 PCR扩增结果检测

2.5 DGGE分析

2.6 16S rDNA片段的克隆

2.6.1 PCR产物的准备

2.6.2连接反应

2.6.3转化

2.6.4筛选—蓝/白斑筛选

2.7测序及后续分析

2.8主要试验仪器

第三章平行AN/AO工艺运行阶段微生物群落结构初步分析

3.1取样条件

3.2活性污泥样品总DNA提取结果

3.3总DNA的PCR扩增结果

3.4变性梯度凝胶电泳分离扩增16S rDNA片段结果

3.5部分优势菌群的16S rDNA片段测序结果及入库比对

3.6本章小结

第四章平行AN/AO工艺除磷菌种群结构分类讨论

4.1取样条件

4.2活性污泥样品总DNA提取结果

4.3总DNA的PCR扩增结果

4.4 PCR产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离

4.5部分优势菌种DGGE片段测序结果及入库比对分析

4.6本章小结

第五章不同电子受体条件对除磷菌种群结构影响分析

5.1样品培养及预处理

5.2培养后活性污泥样品总DNA提取结果

5.3总DNA的PCR扩增结果

5.4变性梯度凝胶电泳分离16S rDNA片段结果

5.5部分优势菌群的DGGE片段测序及入库比对

5.6本章小结

第六章不同pH值条件对除磷菌种群结构影响分析

6.1样品培养及预处理

6.2培养后活性污泥样品总DNA提取结果

6.3总DNA的PCR扩增结果

6.4变性梯度凝胶电泳分离16S rDNA片段结果

6.5部分优势菌群的DGGE片段测序及入库比对

6.6本章小结

第七章结论、讨论与建议

7.1结论

7.2讨论与建议

致谢

参考文献

个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果