IL-1B-31CC/-511TT基因型H.pylori相关CAG全基因表达谱的研究

摘要

背景及目的：
　　 胃癌仍严重危害着人类的健康，尤其在亚洲国家，H.pylori则是导致胃癌发生最为危险的因素。H.pylori感染了世界人口的50％、中国人口的60％，另外，胃癌高发人群90％感染有H.pylori。然而，H.pylori感染后的临床结果却很不相同，从无症状胃炎到胃癌等都有发生，研究证明除了细菌因素还有宿主遗传因素都在其中起着重要作用。H.pylori感染所导致的慢性炎症以及炎症的严重程度和炎症在胃内的分布部位决定了临床结果。CagA、VacA等细菌毒力因子对胃炎的严重程度起着关键性的作用，甚至被看成是致癌蛋白而增加胃癌的发病风险。胃癌好发于以慢性炎症、胃酸缺乏、细菌过度生长和强宿主遗传易感性为特点的情况下。宿主遗传因素不同可对H.pylori感染结果的个体差异做出部分解释，其中，细胞因子家族的基因是宿主遗传因素中最为重要的部分，尤其是IL-1B，它编码的细胞因子起着促炎和抑制胃酸的作用。首次研究发现IL-lB和IL-1R基因多态性与胃癌发病风险有关的报道2000年发表于《Nature》杂志，研究表明IL-1B一31位C等位基因型和-511位T等位基因型是完全连锁遗传的，并可在H.pylori感染的情况下导致胃癌及癌前病变的发病风险增高，此后该结果在来自不同人种的多项研究中都被证实。
　　 Correat提出关于胃癌发生的胃黏膜多阶段改变模式已被广泛接受，在此过程中胃黏膜的显著萎缩伴胃酸缺乏是关键的一步。
　　 迄今为止，尚没有一个系统、全面的宿主基因遗传谱可以用来确定H.pylori感染者中的胃癌高危人群，也很少有关于宿主遗传因素和细菌毒力因子相互作用机制的研究报道。另外，大量人群的SNP检测需要一个高效、高通量和低成本的SNP分型方法。为此，本研究在应用DNA测序和H.pylori检测等方法筛选到最适合的病例入组之后，采用寡核苷酸基因芯片技术，首次研究了IL-1B-31CC/-511TT基因型CAG全基因表达谱，并进一步对携IL-1B-31CC/-511TT基因型的H.pylori相关CAG全基因表达谱进行了分析，最后对多种胃癌易感性相关细胞因子SNP在慢性萎缩性胃炎患者的分布情况进行了解，制备了胃癌易感基因SNP检测芯片，同时为了简化芯片检测过程，本研究还建立了三个多重PCR，产物包括了所有的目标基因SNP位点。
　　 对象和方法：
　　 1.对因慢性上消化道症状而行胃镜检查的患者，通过胃镜和病理诊断入选CAG患者。留取胃窦粘膜活检组织和血样本。并对样本进行IL-1B-31/-511多态性测序分型、免疫印迹H.pylori清分型、快速尿素酶试验和组织学检查。
　　 2.胃窦胃镜活检组织抽提RNA，应用Agilent人全基因表达谱芯片(G4112F)进行检测，比较IL-1B-31CC/-511TT基因型与IL-1B-31TT/-511CC基因型CAG各6例的基因表达谱，筛选与IL-1B-31CC/-511TT基因型相关差异基因，并进一步进行G0分析。
　　 3.抽提胃窦组织RNA，全基因表达谱检测应用Agilent人全基因组寡核苷酸芯片(G4112F)进行。比较携IL-1B-31CC/-511TT基因型慢性萎缩性胃炎H.pylori感染组和H.pylori阴性组各3例的全基因表达谱。筛选差异基因进行G0和Pathway分析，并行qRT-PCR验证芯片结果。H.pylori阳性组进行免疫印迹法血清分型检测。
　　 4.根据最新研究，选择胃癌易感性相关基因SNP位点：IL-1B、IFN-γ、LTA、IL-8、IL-10、TNF-α及MIF7个基因上12个SNP位点，设计、筛选引物。对49例慢性萎缩性胃炎患者的全血DNA，选定引物、PCR扩增，产物纯化后进行Sanger法测序，检测IL-1B-31/-511位点SNP基因型，其中20例患者同样方法检测其余10个SNP位点基因型。优化用于胃癌易感基因SNP检测芯片分析的多重PCR体系，设计、合成并优化探针。芯片点样仪进行胃癌易感基因SNP检测芯片的点制。用一例测序样本对芯片结果进行验证。
　　 结果：
　　 1.68例CAG患者中入选49例进行测序。结果12例合格病例被入选进行IL-1B-31CC/-51lTT基因型CAG全基因表达谱特点的研究，6例满足要求的病例入组用于H.pylori阳性IL-1B-31CC/-511TT基因型CAG的分子表型特点进行研究。
　　 2.与IL-1B-31CC/-511TT基因型相关的慢性萎缩性胃炎差异基因共有307个，上调244个，下调63个；差异基因G0术语注释主要涉及大分子代谢、翻译后蛋白修饰、泛素循环、蛋白激酶级联反应等；可能最具生物学活性基因包括下调基因PCSK5，上调基因PRKCA、NPLOC4、TRIB3、MAPKAPK3等。
　　 3.携IL-1B-31CC/-511TT基因型慢性萎缩性胃炎H.pylori感染组和H。pylori阴性组的全基因表达谱共筛选出差异基因124个，上调73个，下调51个，两组样本同样能被这些差异基因病所明确区分。分析得到32个G0注释，主要涉及细胞内、合成过程、细胞生物合成过程、磷酸化、嘌呤核苷酸生物合成过程等。Pathway分析得到具显著性的信号通路是氧化磷酸化和H.pylori感染上皮细胞信号通路。基因ATP6VOB、NDUFS5、NDUFV2、ATP6V1F和ATP6V1G1为G0和Pathway分析结果中都包含的5个基因。qRT-PCR与芯片检测结果一致。血清分型检测发现研究对象均为产VacA的H.Pylori感染。
　　 4.IL-1B-31/-511位点各等位基因的频率分别为54.1％、45.9％，各基因型百分率均为：30.6％、46.9％、22.4％；其中20例患者其他10个位点各等位基因的平均频率分别为(65.3±26.0)％、(34.8±26.0)％，各基因型平均百分率分别为：(49.5±33.0)％、(31.5±18.9)％、(19.0±20.9)％。三个多重PCR体系可包含所有目标基因SNP位点，制备的胃癌易感基因SNP检测芯片包含有目标基因、3个阳性对照和3个阴性对照。样本的DNA测序与芯片检测结果一致。
　　 结论：
　　 1.通过胃镜、H.pylori检测和DNA测序筛选到了研究IL-1B-31CC/-511TT基因型CAG及伴H.pylori感染时的全基因表达谱特点的合格病例。筛选过程中的试验数据在本课题的后续研究中均充分得到运用。
　　 2.IL-1B-31CC/-511TT基因型慢性萎缩性胃炎具有更多肿瘤、炎症相关的分子表型，这类慢性萎缩性胃炎更需要重视干预治疗和动态监测。
　　 3.H.pylori阳性IL-1B-31CC/-511TT基因型CAG较H.Pylori阴性者具有更多的炎症、肿瘤分子表型，在细菌和宿主相互作用过程中，线粒体的能量代谢受损可能是最为关键的环节，而此损伤的产生与H.pylori毒力因子VacA相关。我们的工作为进一步深入研究H.pylori毒力因子和宿主遗传因素之间复杂的相互作用提供了基础，也有助于确定需要H.pylori根除治疗和严密随访的胃癌高危人群。
　　 4.我国慢性萎缩性胃炎患者中广泛携有多个胃癌易感性相关细胞因子基因SNP，多重PCR体系的建立实现了一次获得多个目标基因片段，较传统的单重PCR和单位点SNP扩增高效，胃癌易感基因SNP检测芯片的制备能同时检测多个SNP，为进一步大范围研究宿主胃癌易感基因SNP在胃癌发生中的分子机制提供了良好的手段和基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第1部分IL-1B-31CC/-511TT基因型H.pylori相关CAG病例筛选

1.1 引言

1.2 对象和方法

1.3 结果

1.4 讨论

1.5 结论

第2部分IL-1B-31CC/-511TT基因型慢性萎缩性胃炎全基因组表达谱的研究

2.1 引言

2.2 对象和方法

2.3 结果

2.4 讨论

1.5 结论

第3部分IL-1B-31CC/-511TT基因型幽门螺杆菌相关慢性萎缩性胃炎全基因组表达谱的研究

3.1 引言

3.2 对象和方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 结论

第4部分胃癌易感性基因SNP在CAG患者中的分布及检测芯片的制备

4.1 引言

4.2 对象和方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 结论

进一步工作方向

致谢

参考文献

附录A：宿主因素与幽门螺杆菌感染结局的研究

个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果