秦巴硒菇水浸物活性成分对血源细胞的正负调节作用

摘要

秦巴硒菇(Agaricus blazei Murrill-Qbsg)是在我国成功栽培的一种富含硒的食用菌。为了研究这一全新食用菌的水溶性成份对血液系统细胞的负调节和正调节作用，分别在4℃、25℃、60℃、100℃四种不同温度下制备秦巴硒菇水浸物，并作用于早幼粒细胞性白血病细胞(K562)，以获得作用效果最佳的秦巴硒菇水浸物。在研究秦巴硒菇水浸物诱导K562凋亡的实验中，运用四氮唑蓝比色法(MTT法)、集落形成计数法、流式细胞检测技术、琼脂糖凝胶电泳法、荧光显微镜、透射电子显微镜以及单细胞逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR）多种方法进行了生物活性、生化检测，形态学观察及凋亡相关基因表达的检测。在研究秦巴硒菇水浸物对血源细胞系分化抗原的影响的实验中，采用了本实验室制备的免疫荧光纳米微球(IFNB)及FACS进行检测。在本研究中，还应用MTT法检测荧光纳米微球对小鼠骨髓细胞、K562细胞、Hela细胞是否具有毒性作用；并应用本实验室制备的磁性纳米粒子直接从细胞裂解液中分离获得提取mRNA的研究。 实验结果证明，在四个不同温度条件下制备的秦巴硒菇水浸物对K562肿瘤细胞的抑制作用的实验研究中，发现60℃下制备的秦巴硒菇水浸物效果最佳，与对照组相比，具有显著性差异(P<0.01)，且作用时间在24h～72h间，抑制率与作用时间呈正相关。通过FACS检测其诱导K562肿瘤细胞72h时有明显的亚二倍体峰出现；在形态学研究中观察到K562肿瘤细胞呈现典型的凋亡形态：膜起泡，细胞核固缩，染色质浓缩、边集化形成新月形结构，产生凋亡小体等。通过单细胞RT-PCR检测法证明了秦巴硒菇水浸物可增强p53、Fas、Caspase-3等基因的表达活性。在秦巴硒菇水浸物对血源细胞系分化抗原影响的研究中发现，秦巴硒菇水浸物能有效地促进人脐血单个核细胞中的造血干细胞向红系、粒系、B细胞、T细胞分化。在检测荧光纳米微球对细胞的毒性实验中发现，本实验室制备的荧光纳米微球对小鼠骨髓细胞、K562、Hela细胞的生长均无明显的毒性；通过RT-PCR进行β-actin基因的扩增最终证明本实验室制备的磁性纳米粒子能有效地从裂解液中直接分离获得mRNA，可用于扩增基因。 因此，通过实验发现通过低温萃取获得的60℃下的秦巴硒菇水浸物中的活性成份具有可以诱导K562肿瘤细胞的凋亡和血源细胞系向不同谱系分化的正负两种不同的调节作用。本实验室制备的荧光纳米微球对细胞的生长无明显的毒性作用，为体内实验提供了研究的前提；同时我们制备的磁性纳米粒子也能有效地从裂解液中直接分离获得mRNA，为mRNA的快速分离纯化提供了条件。

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第一章综述

§1.1秦巴硒菇的研究

§1.2单细胞RT-PCR技术及应用研究

§1.3纳米粒子的研究

第二章秦巴硒菇水浸物生物活性研究

§2.1秦巴硒菇水浸物诱导K562肿瘤细胞凋亡的活性及生化检测

2.1.1材料与方法

2.1.2结果与分析

2.1.3讨论

§2.2秦巴硒菇水浸物诱导K562肿瘤细胞凋亡的形态学观察

2.2.1材料与方法

2.2.2结果与分析

2.2.3讨论

§2.3秦巴硒菇水浸物诱导K562肿瘤细胞凋亡的分子机理探讨

2.3.1材料与方法

2.3.2结果与分析

2.3.3讨论

§2.4纳米微球在秦巴硒菇水浸物对血源细胞系分化抗原的影响及磁分离mRNA的应用研究

2.4.1材料与方法

2.4.2结果与分析

2.4.3讨论

§2.5结论

致谢

参考文献

研究成果