p53基因的克隆、原核表达及功能初步研究

摘要

目的：原核表达P53重组蛋白，检测P53重组蛋白对人类白血病细胞系K562和人肝癌细胞系SMMC—7721体外增殖的影响。 方法：运用PCR技术鉴定了pET—p53重组质粒导入BL21菌株中p53基因的存在，并在IPTG的诱导下，大量产生外源基因产物。通过Ni—NAT亲和层析柱纯化分离P53蛋白，SDS—PAGE确定该蛋白准确性。以不同浓度经磁性荧光纳米粒子(FMNP)修饰后的P53重组蛋白诱导K562细胞和SMMC—7721细胞，用MTT比色法、集落形成法、流式细胞术(FCM)测定P53蛋白对靶细胞增殖的影响。利用激光共聚焦显微镜(LSCM)观察经磁性荧光纳米粒子修饰的P53重组蛋白在细胞中的定位。 结果：1.成功的构建了含人野生型p53基因的原核表达载体，分离纯化了P53重组蛋白。2.磁性荧光纳米粒子修饰的P53重组蛋白较未修饰的蛋白有更好的凋亡诱导作用，且磁性纳米粒子本身并不具细胞毒害作用；3.P53重组蛋白抑制K562肿瘤细胞的生成，随药物剂量增大细胞凋亡率上升，其半数抑制浓度(IC50)为6.74μg/ml；4.随着P53重组蛋白浓度的增加，SMMC—7721细胞存活率显著降低，并发现该蛋白能促进肿瘤细胞凋亡，且呈现明显的剂量依赖性，其半数抑制浓度(IC50)为12.39，μg/ml；5.激光共聚集显微镜观察发现P53重组蛋白主要定位于细胞核，胞浆也有少量分布。 结论：原核表达的P53重组蛋白具有野生型P53(wtp53)蛋白活性，体外实验发现经磁性荧光纳米粒子修饰的P53重组蛋白能够抑制K562细胞和SMMC—7721细胞生长并促使它们发生凋亡。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文词汇对照

声明

第一章综述

一p53的研究进展

二核壳型纳米粒子在生物学中的应用

第二章实验部分

一p53基因的克隆表达及纯化

0前言

1材料与方法

2实验结果与分析

3讨论

二P53重组蛋白对K562肿瘤细胞凋亡的活性测定

0前言

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

三P53重组蛋白对SMMC-7721肿瘤细胞凋亡的活性测定

0前言

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

四P53磁性荧光纳米复合体的制备及其细胞成像实验

0前言

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

五结论

参考文献

附录攻读硕士学位期间主要研究成果

致谢