云芝Cov-Ⅰ菌株的诱变育种、提取工艺及发酵条件的探究

摘要

云芝糖肽是从液体发酵的云芝[Coriolus versicolor(L.er.Fr)Qu'ei.]Cov-I菌丝体中水提醇沉得到的一种多糖肽，具有抗肿瘤和提高机体免疫功能的显著效果，并已批准作为肿瘤辅助治疗药物。采用液体发酵和水提醇沉工艺生产的云芝糖肽存在着得率低、成本高的技术瓶颈。为提高生产效率、降低成本、增加收益，本论文从云芝诱变育种、发酵工艺和提取工艺优化三个方面来寻找突破技术瓶颈的方法。
　　 本文以云芝Cov-I菌株为出发菌株制备云芝原生质体，采用紫外诱变进行原生质体诱变育种，并结合溶壁酶的耐受能力进行筛选。从诱变得到的301株菌中筛选到1株遗传性质较稳定、适合液体培养的云芝诱变菌株——YUBV93。该菌在PDA斜面上生长速度较快，菌丝茂密，经液体发酵培养得到的菌丝体干重、粗多糖肽得率及产品中总多糖含量均略高于出发菌株。
　　 通过对云芝中糖肽类物质提取工艺的研究，确定了提取云芝胞内糖肽类物质的优化工艺条件，并对提取的糖肽类物质进行了糖和蛋白质的定量分析。结果，水提法获取的云芝糖肽得率为4.9％，总糖含量为36.8％、蛋白含量为26.5％；碱提法获取的云芝胞内糖肽得率为10.4％，总糖含量为39.0％、蛋白含量为28.0％；冷碱提残渣获取的云芝胞内糖肽得率为3.6％，总糖含量为37.3％、蛋白含量为27.0％；热碱提残渣获取的云芝胞内糖肽得率为3.8％，总糖含量为38.2％、蛋白含量为27.8％；云芝胞外糖肽的得率为1.15％，总糖含量为50.2％、蛋白含量为30.5％。提取云芝胞内糖肽类物质的优化条件为：先用传统的水提醇沉法提取水溶性糖肽类物质，再依次用25℃冷碱和90℃热碱各提取菌丝体残渣2次以获取碱溶性糖肽类物质。
　　 对云芝菌丝体发酵工艺的研究发现，Mg2+、Ca2+、EDTA、甘油和植物油对云芝菌丝体及其糖肽产量都有促进作用。通过单因素比较研究确定了Mg2+、Ca2+、EDTA、甘油和植物油的最适添加量分别为0.3％、0.3％、0.0002％、3％和7％，此条件下每150mL发酵液中干菌丝体的产量分别为1.52g、1.41g、1.40g、1.69g、2.25g，比原培养基的产量分别提高了26％、17％、18％、37％和87％，而菌丝体中云芝糖肽的提取率及其总糖含量则无明显改变，分别为4.93％、4.87％、4.92％、4.97％、4.99％和36.97％、37.02％、36.85％、36.84％、36.90％。
　　 以YUBV93为出发菌株，发酵培养基中添加7％的植物油和0.3％的MgCl2并采用优化的提取条件后，每升菌丝体干重可达3.49g、胞内糖肽得率12.52％、总糖含量37.85％、蛋白含量28.13％，比原始的工艺分别提高了86.8％、153.9％、2.5％和6.1％。

目录

文摘

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声明

第一章 绪论

1.1立题背景与依据

1.1.1引人注目的糖和糖生物学

1.1.2新型的抗肿瘤免疫调节剂——真菌多糖

1.1.3具有确切抗癌效果的云芝及云芝糖肽

1.2立题意义

第二章 诱变育种选育云芝糖肽高产菌株

2.1引言

2.2材料和方法

2.2.1材料、试剂与仪器

2.2.2培养方法

2.3 云芝原生质体紫外诱变结合溶壁酶诱导法

2.3.1云芝原生质体的制备

2.3.2云芝原生质体紫外诱变结合溶壁酶诱导法育种

2.4诱变菌株的筛选

2.4.1初筛

2.4.2复筛

2.5结果与讨论

2.5.1诱变菌株的筛选

第三章 云芝糖肽类物质的提取工艺探究

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1材料、试剂与仪器

3.2.2实验方法

3.3结果和讨论

3.3.1云芝胞外糖肽的提取

3.3.2水提醇沉法提取云芝糖肽

3.3.3碱提取法提取云芝胞内糖肽

3.3.4水提醇沉法提取菌丝体残渣云芝糖肽

3.3.5冷碱和热碱提取法提取菌丝体残渣胞内糖肽

3.3.6粗多糖肽分子量的测定

3.3.7不同提取法获取的糖肽类物质的分析比较

3.4本章小结

第四章 云芝糖肽发酵工艺的探究

4.1引言

4.2材料和方法

4.2.1材料、试剂与仪器

4.2.2实验方法

4.3结果与讨论

4.3.1 Mg2+、Ca2+、S042-、EDTA甘油和植物油对云芝发酵产量的影响

4.3.2 Mg2+浓度对云芝发酵产量的影响

4.3.3 Ca2+浓度对云芝糖肽产量的影响

4.3.4 EDTA浓度对云芝糖肽产量的影响

4.3.5甘油浓度对云芝糖肽产量的影响

4.3.6植物油浓度对云芝糖肽产量的影响

4.3.7 Mg2+、Ca2+、EDTA的加入时间对云芝糖肽产量的影响

4.3.8甘油、植物油的加入时间对云芝发酵产量的影响

4.3.9云芝中糖肽类物质生产工艺的优化

4.4本章小结

致 谢

参考文献