鳝鱼蛋白质成分分离与生物活性研究

摘要

对生物大分子的提取、分离及纯化是开发其功能、探讨其在生物体中的生命现象，进而发挥其生物学活性的重要前提。本论文首先从黄鳝新鲜血液中得到血清，分别用（NH4）2SO4、Na2SO4和辛酸-（NH4）2SO4溶液盐析法提取粗蛋白，采用阴离子交换柱层析（填料为DE52）纯化球蛋白。采用SDS-PAGE凝胶电泳法，对样品中蛋白的纯度和分子量进行了测定。运用生物质谱法对样品蛋白进行分析鉴定，通过搜库比对确定其种类、基因序列和精确的分子量。然后对该蛋白进行了物理化学性质的表征。采用原子力显微镜表征蛋白质表面形貌，所用探针微悬臂为氧化蚀刻硅微悬臂。运用圆二色谱仪对黄鳝血清转铁蛋白的二级结构进行了表征，样品蛋白液的测量范围为远紫外区，即190-260nm。最后对该蛋白的生物学活性做了简单的初步探索，选择操作简单、重复性好的MTT法抗癌药物敏感试验检测蛋白对白血病细胞株的作用。
　　黄鳝（Monopterus albus），属合鳃鱼目，合鳃鱼科，黄鳝属。广泛分布在热带及亚热带地区，在我国东南部地区，在泰国、印度尼西亚等东南亚地区均有大量分布。由于它富含营养、肉质鲜美、有多种对人体有益的氨基酸，特别是中医还将黄鳝作为重要的药材，因此它深受世界上广大消费者的喜爱。前人已经有很多关于黄鳝形态学、繁殖行为和经济价值的研究。但是还没有关于黄鳝血清转铁蛋白的表征及生物活性方面的研究。黄鳝血的利用率极低，因此选择黄鳝的血为实验材料。
　　本实验采用离子交换柱层析法对提取出的蛋白进行纯化。使用的是DE52阴离子交换柱层析填料，蛋白样品的上样量为10mg(约4ml)，柱层析的洗脱速度0.3ml/min。
　　本实验采用SDS-PAGE凝胶电泳法，对样品中蛋白的纯度和分子量进行了测定，浓缩胶浓度4％，分离胶浓度12.5％。结果显示电泳得到两条清晰的条带，根据文献，选择分子量较大的蛋白进行接下来的种类鉴定、物理化学性质表征和生物活性实验。
　　本实验中利用生物质谱法对得到蛋白的种类进行鉴定。生物质谱法的实验步骤可概括为：黄鳝蛋白液浓缩后，经酶切，毛细管色谱分离，进入质谱进行鉴定。产生的串联质谱图生成质量数据文件在设置 SEQUEST结果过滤参数后于Smegmamorpha蛋白库中进行检索比对。
　　实验中采用原子力显微镜表征蛋白质表面形貌，AFM的优点在于：观察的样品范围很广，AFM可在真空、空气、液相中观察样品；由于可在液态环境中观察，故AFM可在生理条件下对活细胞进行观察，并可实时观察某些动态的生化反应；成像时间短，可捕捉一些快速反应过程。本实验所用探针微悬臂为氧化蚀刻硅微悬臂，采用Tapping（轻敲模式）成象，所用基片为新剥离的云母片，蛋白液通过静电作用结合在经过处理的云母表面，其异相界面的存在环境与其在膜上的环境具有相似性。
　　圆二色谱法是测定蛋白质结构的一种重要手段。不管是在远紫外区还是近紫外区，CD光谱均可被经验地作为特定蛋白的

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第一章 前言

1.1 前人中医研究鳝鱼工作积累

1.2 现代医学对鳝鱼的研究工作

1.3 转铁蛋白的研究进展

1.4 生物蛋白分离与鉴定技术

1.5本论文的设计方案

第二章 实验

2.1 黄鳝血清转铁蛋白的提取、分离方法

2.2 黄鳝血清转铁蛋白的物理化学性质表征

2.3 黄鳝血清转铁蛋白的生物活性研究

第三章 结果与讨论

3.1 黄鳝血清转铁蛋白的提取分离方法

3.2 黄鳝血清转铁蛋白的物理化学性质表征

3.3 血清转铁蛋白的生物活性研究

第四章 结论、展望与创新及有待进一步开展的工作

4.1结论与展望

4.2创新点与接下来的工作

致谢

参考文献

作者简介

攻读学位期间发表的学术论文

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