基于LAMP和荧光定量PCR技术的猪圆环病毒2型和猪细小病毒检测试剂盒的研制

摘要

断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)是由猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type2，PCV2)引起的一种重要疾病，严重发病地区死亡率高达40％以上，残存下来的病猪也极少康复。由于PCV2严重破坏猪的免疫系统，导致各种疫苗接种应答效果差，免疫失败，并且诱发其他疾病暴发。因此， PCV2感染的早期诊断和病猪的淘汰成为PMWS防治的重点。有必要开发出一种猪PCV2的定性、定量快速检测方法用于PMWS的防控。猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)引起的以初产母猪发生流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等为特征的猪的主要繁殖障碍性疾病之一，此外，PPV能增强猪圆环病毒引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征。PPV分布广泛，通过水源、食物、交配、胎盘等途径感染猪，并能在外界环境长时间存活且对大部分消毒剂不敏感，难于防治，给养猪业带来巨大危害。所以非常有必要建立一种快速、特异并适合在基层推广的检测方法。
　　本实验旨在建立PCV2环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification， LAMP)和荧光定量PCR检测方法以及PPV环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification， LAMP)检测方法，研制PCV2和PPV的LAMP现场可视化快速定性检测试剂盒和PCV2荧光定量PCR定量检测试剂盒，并对反应体系和参数进行优化以及对制备工艺进行研究。主要内容及结果如下:
　　1、猪细小病毒(PPV)LAMP可视化快速检测方法建立及试剂盒的研制
　　本研究旨在建立有效的针对猪细小病毒(PPV)的诊断技术及开发试剂盒。建立一种快速、敏感、特异的检测猪细小病毒(PPV)的环介导等温扩增(LAMP)方法，为诊断猪细小病毒提供准确可靠工具。根据GenBank公布的PPV序列，利用PrimerExplorer V3在其保守序列区域设计了LAMP引物，通过对引物比例、反应温度、反应时间、PCR各组分等条件的优化，建立了对PPV病毒DNA进行特异扩增的LAMP检测方法，研制LAMP检测试剂盒，并对试剂盒敏感性、特异性、重复性和保存期等指标进行评价。该方法在60℃恒温下作用50 min，PPV病毒DNA获得了高效率的特异性扩增;用该检测试剂盒对临床样品进行检测，LAMP检测对PPV的检测限为10拷贝/μL，而常规PCR检测法的检测限为1000拷贝/μL，表明LAMP检测法灵敏度高。该检测法不会与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)发生交叉反应。用该检测试剂盒对1100个临床样品进行检测，320个样品被检测出为阳性样品。稳定性试验表明该试剂盒可以耐受至少40次的反复冻融。结果显示，本实验建立的方法和研制的猪细小病毒检测试剂盒灵敏度高，特异性强，稳定性好，为猪细小病毒的检测和流行病学的调查提供了一种简单快速的诊断方法。
　　2、猪圆环病毒2型(PCV2) LAMP可视化快速检测方法建立及试剂盒的研制
　　本研究旨在建立有效的针对猪圆环病毒2型(PCV2)的诊断技术及开发试剂盒。建立一种快速、敏感、特异的检测猪圆环病毒2型(PCV2)环介导等温扩增（LAMP）方法，为诊断猪圆环病毒2型提供准确可靠工具。根据GenBank公布的PCV2序列，利用PrimerExplorer V3在其保守序列区域设计了LAMP引物，通过对引物比例、反应温度、反应时间、PCR各组分等条件的优化，建立了对PCV2病毒DNA进行特异扩增的LAMP检测方法，研制LAMP检测试剂盒，并对试剂盒敏感性、特异性、重复性和保存期等性能进行评价。该方法在59℃恒温下作用45 min，PCV2病毒DNA获得了高效率的特异性扩增。用该检测试剂盒对临床样品进行检测，LAMP检测对PCV2的检测限为10拷贝/μL，而常规PCR检测法的检测限为1000拷贝/μL，表明该试剂盒灵敏度高。该检测试剂盒不会与猪瘟病毒(CSFV)、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应。用研制的试剂盒对1100个临床样品进行检测，950个样品被检测出为阳性样品。稳定性试验表明该试剂盒可以耐受至少40次的反复冻融。成功建立了特异性检测PCV2的LAMP方法，试剂盒具有良好的特异性、重复性和敏感性，可用于临床PCV2感染的快速检测及分子流行病学调查。
　　3、猪圆环病毒2型(PCV2) TaqMan荧光定量PCR检测方法建立及试剂盒的研制
　　本研究旨在建立有效的针对猪圆环病毒2型(PCV2)的诊断技术及开发试剂盒。根据GenBank公布的PCV2序列，对PCV2的ORF2基因设计相应的特异性引物和探针，通过体系优化，以重组质粒建立10倍系列稀释的质粒标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线，建立了对PCV2病毒DNA进行特异扩增的荧光定量PCR检测方法，研制荧光定量PCR检测试剂盒，并对试剂盒敏感性、特异性、重复性和保存期等性能进行评价。该检测试剂盒循环阈值(Ct)与标准DNA模板在101-107拷贝/μL浓度范围内具有极好的线性关系，相关系数为0.9999。本实验重复性好，批内实验中Ct值的变异系数在0.59％到1.05％之间，批间实验的Ct值变异系数为1.9％到4.2％。本实验研制的检测试剂盒与猪瘟病毒(CSFV)、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)不发生交叉反应，检测极限和定量极限分别为10和100拷贝数。用该试剂盒对1000个临床样品进行检测，结果710个被检测为阳性。结果显示，该方法和所研制的猪圆环病毒2型检测试剂盒灵敏度高，特异性强，稳定性好，实现了对PCV2早期诊断和感染程度定量分析检测，为PCV2的防制和疫苗研制奠定了一定基础。

目录

摘要

第1章 绪论

1．1 猪主要DNA病毒及其检测方法简介

1．1．1 猪细小病毒简介及其检测方法研究进展

1．1．2 猪圆环病毒2型简介及其检测方法研究进展

1．2 猪病常用核酸诊断技术简介

1．2．1 环介导等温扩增技术

1．2．2 实时荧光定量PCR技术

1．3 研究的目的和意义

1．4 创新点与先进性

1．5 技术路线

1．5．1 研制PPV LAMP检测试剂盒的技术路线

1．5．2 研制PCV2 LAMP检测试剂盒的技术路线

1．5．3 研制PCV2荧光定量PCR检测试剂盒的技术路线

第2章 猪细小病毒LAMP可视化快速检测试剂盒的研制及应用

2．1 材料

2．1．1 病毒来源

2．1．2 引物

2．1．3 主要试剂(盒)

2．1．4 主要仪器和设备

2．2 方法

2．2．1 培养基及溶液的配制

2．2．2 猪细小病毒DNA的提取

2．2．3 普通PCR反应体系

2．2．4 PCR产物的克隆与测序检测

2．2．5 标准品阳性质粒模板的制备

2．2．6 PPV LAMP检测方法的建立

2．2．7 PPV LAMP可视化试验

2．2．8 PPV LAMP试剂盒的组装

2．2．9 猪细小病毒LAMP检测试剂盒的灵敏度试验

2．2．10 猪细小病毒LAMP检测试剂盒的特异性试验

2．2．11 猪细小病毒LAMP检测试剂盒的稳定性试验

2．2．12 PPV LAMP可视化快速检测试剂盒的应用

2．3 结果与分析

2．3．1 PPV的PCR扩增产物的检测

2．3．2 PCR产物的克隆与测序检测

2．3．3 反应条件的优化

2．3．4 猪细小病毒LAMP检测试剂盒的灵敏度试验

2．3．5 猪细小病毒LAMP检测试剂盒的特异性试验

2．3．6 猪细小病毒LAMP检测试剂盒的稳定性试验

2．3．7 PPV LAMP反应可视化结果的判定

2．3．8 猪细小病毒LAMP检测试剂盒的临床样品检测

2．4 讨论

第3章 猪圆环病毒2型LAMP可视化快速检测试剂盒的研制及应用

3．1 材料

3．1．1 病毒来源

3．1．2 引物

3．1．3 主要试剂

3．2 方法

3．2．1 病毒标准阳性质粒模板的制备

3．2．2 PCV2 LAMP检测方法的建立

3．2．3 PCV2 LAMP可视化试验

3．2．4 PCV2 LAMP试剂盒的组装

3．2．5 猪圆环病毒2型LAMP检测试剂盒的灵敏度试验

3．2．6 猪圆环病毒2型LAMP检测试剂盒的特异性试验

3．2．7 猪圆环病毒2型LAMP检测试剂盒的稳定性试验

3．2．8 PCV2 LAMP可视化快速检测试剂盒的应用

3．3 结果与分析

3．3．1 优化的LAMP反应体系和反应条件

3．3．2 PCV2 LAMP可视化快速检测试剂盒的研制

3．3．3 PCV2 LAMP可视化快速检测试剂盒的灵敏度实验

3．3．4 PCV2 LAMP可视化快速检测试剂盒的特异性试验

3．3．5 猪圆环病毒2型LAMP检测试剂盒的稳定性试验

3．3．6 PCV2 LAMP反应可视化结果的判定

3．3．7 猪圆环病毒2型LAMP可视化快速检测试剂盒的临床样品检测

3．4 讨论

第4章 猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测试剂盒的研制及应用

4．1 材料

4．1．1 病毒来源

4．1．2 引物

4．1．3 主要试剂

4．2 方法

4．2．1 标准品浓度的计算

4．2．2 实时荧光定量PCR检测方法的建立

4．2．3 标准曲线的建立

4．2．4 PCV2荧光定量PCR定量检测试剂盒的组装和说明书

4．2．5 PCV2的荧光定量PCR检测试剂盒特异性试验

4．2．6 PCV2的荧光定量PCR检测试剂盒灵敏度试验

4．2．7 PCV2的荧光定量PCR检测试剂盒重复性试验

4．2．8 临床样品检测

4．2．9 PCV2荧光定量PCR检测试剂盒的应用

4．3 结果与分析

4．3．1 实时荧光定量PCR检测方法的建立

4．3．2 标准曲线的建立

4．3．3 PCV2荧光定量PCR检测试剂盒的研制

4．3．4 PCV2荧光定量PCR检测试剂盒的特异性试验

4．3．5 PCV2荧光定量PCR检测试剂盒的灵敏度试验

4．3．6 PCV2的荧光定量PCR检测试剂盒重复性试验

4．3．7 PCV2的荧光定量PCR检测试剂盒的临床样品检测

4．4 讨论

第5章 全文总结

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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