辐照与正常捻转血矛线虫幼虫排泄分泌蛋白的比较研究

摘要

捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是一种寄生性线虫，严重危害羊等反刍动物，通常会寄生在反刍动物的真胃，并导致宿主血红素沉积。在羊感染捻转血矛线虫后，不但会产生贫血、消瘦和衰弱等症状，甚至引起死亡，给羊业生产带来巨大的损失。目前，防治捻转血矛线虫病的措施主要是使用驱虫药，然而，随着耐药菌株和药物残留的出现，迫切需要通过免疫预防来控制捻转血矛线虫病。因此越来越多的研究学者致力于捻转血矛线虫疫苗的研究。之前的研究表明，不同类型的辐照减毒幼虫疫苗可诱导针对不同类型寄生虫的高水平保护性免疫，但同时却存在着寄生虫材料大量获取的限制，以及利用捻转血矛线虫幼虫解决保护效应的不确定性等问题。因此，如果能将分子疫苗与辐照致弱疫苗的优点结合起来，就能为成功研发出高效安全的抗捻转血矛线虫疫苗找到突破口。所以对捻转血矛线虫诱导的保护性免疫的细胞和分子机制的研究迫在眉睫。 先前的研究表明，用RA捻转血矛线虫幼虫进行感染可以在绵羊/山羊中诱导更高水平的保护性免疫；而在正常捻转血矛线虫幼虫感染的宿主中没有观察到保护作用。此外，在本实验室最近的一项研究中发现，体外培养的正常和RA捻转血矛线虫幼虫/细胞可分别显示凋亡和坏死表型。这些研究表明来源于RA捻转血矛线虫幼虫的细胞/分子的免疫生物学功能和性质不同于来自正常幼虫的细胞/分子的免疫生物学功能和性质。然而，造成这种差异的细胞和分子机制尚不清楚。我们推测RA捻转血矛线虫幼虫释放的排泄分泌蛋白（ESPs）的组分、表达水平和免疫生物学功能与正常幼虫的ESPs不同。也就是说，RA幼虫的ESPs可能含有更多的免疫原性分子，而来自正常幼虫的ESPs含有更多耐受性抗原。因此，我们开展了RA和正常捻转血矛线虫幼虫（L3）的ESPs的鉴定及其免疫学功能的初步研究。 我们首先分析了RA和正常捻转血矛线虫L3幼虫组的ESPs的分子组分和表达水平。体外培养不同期别（5d，10d，13d和16d）的辐照与正常捻转血矛线虫L3幼虫，收集培养上清，采用超滤、冻干的方法浓缩蛋白，从而收集不同期别的辐照与正常L3幼虫ESPs。后应用iTRAQ技术与液相色谱-串联质谱法比较RA与正常L3幼虫组之间ESPs蛋白质组的差异，共鉴定出186个显著性差异蛋白。进一步的生物信息学分析结果表明，早期阶段，正常组细胞凋亡相关的分子/通路更为富集，而RA幼虫组中更多的分子/通路与免疫原性坏死有关；在晚期阶段，与正常组相比，RA幼虫组与坏死或细胞死亡相关的分子/通路更为富集。我们还发现RA组与免疫性坏死相关的危险信号分子HSP90和ATPase的表达水平高于正常组的；而正常组中与凋亡相关的谷胱甘肽S转移酶和细胞色素C的表达水平高于RA幼虫组的。这些现象表明来自RA幼虫的ESPs可能含有更多免疫原性分子，而来自正常幼虫的ESPs含有更多与凋亡相关的蛋白质。 此外，我们初步研究了RA和正常捻转血矛线虫幼虫L3的ESPs的免疫功能。采用Transwell共培养体系，将RA与正常捻转血矛线虫L3幼虫与山羊外周血单核细胞（PBMC）共培养24h。采用RT-PCR方法检测PBMC细胞因子mRNA的表达水平。通过Griess方法检测RA和正常幼虫的ESPs刺激PBMC的NO分泌情况。利用Transwell细胞迁移体系分析RA和正常幼虫L3组的ESPs对山羊PBMC迁移的影响。结果发现，在用RA幼虫ESPs刺激的PBMC中，细胞因子（包括促炎性IFN-γ，抗炎性IL-4、IL-10和调节性细胞因子IL-17）的mRNA表达水平显著高于正常幼虫ESPs刺激的PBMC中的mRNA表达水平；与RA幼虫的ESPs共孵育的迁移性PBMC的数量大于和正常幼虫共孵育的迁移性PBMC的数量。我们还发现，用RA幼虫组的ESPs刺激的PBMC可以产生更多的NO。这些研究表明，来自RA幼虫的ESPs可能具有免疫增强和调节的功能，而来自正常幼虫的ESP具有免疫抑制的性质。 总之，在本研究中，我们发现来自RA幼虫的ESPs可能具有更多的免疫原性分子和免疫增强功能，而来自正常幼虫的ESPs含有更多致耐受性抗原并且可能具有免疫抑制性质。为进一步阐明捻转血矛线虫幼虫疫苗诱导高保护性免疫的分子机制奠定了基础。

目录

英文缩略表

第一章 绪论

1.1 捻转血矛线虫概述

1.1.1 捻转血矛线虫及其生活史

1.1.2 捻转血矛线虫病及其研究现状

1.1.3 捻转血矛线虫感染及宿主免疫应答

1.1.4 辐照致弱捻转血矛线虫及其诱导免疫保护作用机制

1.1.5 辐照与正常捻转血矛线虫L3幼虫的研究现状

1.2 排泄分泌蛋白的免疫生物学概述

1.2.1 排泄分泌蛋白

1.2.2 排泄分泌蛋白与宿主免疫调节

1.2.3 蛋白质组学在排泄分泌蛋白中的应用

1.3 细胞凋亡与坏死

1.3.1 细胞凋亡与坏死

1.3.2 细胞凋亡通路

1.4 等重同位素多标签相对和绝对定量蛋白质组学（iTRAQ）

1.4.1 iTRAQ实验原理

1.4.2 iTRAQ技术优势

1.5 Transwell介绍

第二章 辐照与正常捻转血矛线虫幼虫ESPs的iTRAQ分析

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 实验主要试剂和仪器

2.1.3 主要溶液配制

2.2 实验方法

2.2.1 体外培养不同时期L3幼虫ESPs的收集

2.2.2 蛋白质质量检测

2.2.3 SDS-PAGE电泳

2.2.4 酶解和肽段定量

2.2.5 肽段标记

2.2.6 SCX分级

2.2.7 毛细管高效液相色谱

2.2.8 质谱鉴定

2.2.9 质谱数据分析

2.2.10 RT-PCR验证

2.3 实验结果

2.3.1 SDS-PADE电泳鉴定结果

2.3.2 蛋白质鉴定统计

2.3.3 鉴定蛋白的分子量和覆盖率统计

2.3.4 鉴定肽段长度分布

2.3.5 显著性差异表达蛋白数量统计

2.3.6 差异表达蛋白GO富集分析

2.3.7 差异表达蛋白COG分析

2.3.8 差异表达蛋白Pathway富集分析

2.3.9 捻转血矛线虫L3幼虫凋亡坏死相关蛋白分析

2.3.10 捻转血矛线虫L3幼虫凋亡坏死相关蛋白RT-PCR验证

2.4 讨论

第三章 辐照与正常捻转血矛线虫幼虫ESPs免疫学功能的比较研究

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

3.1.2 实验主要试剂和仪器

3.1.3 主要溶液配制

3.2 实验方法

3.2.1 山羊PBMC的分离

3.2.2 捻转血矛线虫L3幼虫的收集

3.2.3 辐照与正常捻转血矛线虫L3幼虫与PBMC共培养

3.2.4 RT-PCR法检测PBMC细胞因子mRNA水平的表达

3.2.5 Griess法检测L3幼虫ESPs刺激PBMC后NO分泌情况

3.2.6 L3幼虫ESPs对PMBC细胞迁移

3.3 实验结果

3.3.1 辐照与正常捻转血矛线虫L3幼虫与PBMC共培养

3.3.2 L3幼虫ESPs对PBMC细胞因子mRNA水平表达的影响

3.3.3 L3幼虫ESPs刺激PBMC后NO分泌情况

3.3.4 L3幼虫ESPs对PMBC细胞迁移的影响

3.4 讨论

第四章 全文总结

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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