集胞藻6803中PII的敲除增加NDH-1介导的呼吸及环式电子传递

摘要

碳源和氮源是蓝藻细胞中蛋白质和核酸等重要有机物的组成成分。因此，碳/氮比例需要保持在一个稳定的水平才能维持蓝藻细胞的正常生命活动。由于蓝藻生长的外界环境始终处于变化之中，因此，为了保持碳氮平衡，蓝藻发展了多种调节碳氮平衡的机制。 蓝藻NDH-1复合体位于类囊体膜上，能介导细胞呼吸、围绕光系统Ⅰ（PSI）的环式电子传递和CO2吸收；这三种功能主要在碳代谢过程中发挥重要作用。PⅡ蛋白是一个广泛存在于细菌、古生菌和植物中的信号传导蛋白，在氮代谢中起着核心调节作用。先前的研究结果显示，在NdhB亚基的缺失突变株（M55）中， PⅡ蛋白发生去磷酸化。这一结果说明NDH-1不仅参与调节碳代谢，而且还参与氮代谢的调节过程。那么，PⅡ蛋白是否能够通过调节NDH-1的活性，进而参与调节碳代谢呢？ 本文通过构建蓝藻集胞藻6803（Synehocysits sp. strain PCC6803）PⅡ蛋白的缺失突变株（ΔPⅡ），从生理水平检测其对NDH-1活性的影响，并通过构建PⅡ蛋白和NDH-1亚基双突变株，以验证ΔPⅡ对NDH-1活性的影响。主要研究结果简述如下： （1）为了检测PⅡ蛋白对NDH-1活性的影响，我们定向构建了PⅡ的缺失突变株（ΔPⅡ）及过表达株（OX-PⅡ）。通过叶绿素荧光等仪器，检测WT、ΔPⅡ和OX-PⅡ株系中的NDH-1活性参数。研究结果发现PⅡ的缺失能够增加NDH-1的总活性，PⅡ的过表达能够降低NDH-1的总活性。 （2）为了确定PⅡ蛋白对NDH-1介导的环式电子传递及呼吸活性的影响，我们通过P700氧化还原动力学曲线及P700+的暗还原等技术检测WT、ΔPⅡ和OX-PⅡ株系中NDH-1介导的环式电子传递速率，我们发现PⅡ蛋白的缺失能够增加NDH-1介导的环式电子传递速率（ NDH-CET）， PⅡ蛋白的过表达能够降低NDH-CET；通过检测WT、ΔPⅡ株系中的呼吸速率，我们发现PⅡ蛋白的缺失能够增加NDH-1介导的呼吸速率。 （3）为了验证PⅡ蛋白的缺失对NDH-CET活性影响，我们在ΔPⅡ背景下敲除只影响NDH-CET活性的NDH-1亚基NdhV，然后检测其NDH-CET活性，结果显示PII和ndhV双突变株（ΔPII/ndhV）中NDH-CET活性低于ΔPⅡ。说明ΔPⅡ确实增加了NDH-1介导的环式电子传递速率。为了验证PⅡ蛋白的缺失对NDH-1介导的呼吸活性影响，我们在PⅡ蛋白缺失突变株背景下敲除影响NDH-1介导呼吸活性的NDH-1亚基NdhD2，然后检测其呼吸活性。研究结果显示PⅡ和ndhD2双突变株（ΔPII/ndhD2）中NDH-1依赖的呼吸活性增加。这一结果说明ΔPⅡ确实增加了NDH-1介导的呼吸速率。 （4）为了检测NDH-1介导的呼吸及环式电子活性改变后对ΔPⅡ突变株的影响，我们检测了WT、ΔPⅡ、ΔPⅡ/ndhV、ΔPⅡ/ndhD2中的活性氧含量（reactive oxygen species, ROS），结果显示ΔPⅡ/ndhV中ROS高于WT，而ΔPII/ndhD2中ROS含量低于WT。说明ΔPⅡ中NDH-1活性增加能够降低细胞中ROS含量。 综上所述，蓝藻中PⅡ蛋白的缺失增加了NDH-1介导的呼吸及环式电子传递速率，ΔPⅡ中NDH-1活性的增加有助于降低细胞中ROS的积累。

目录

缩写

第1章 文献综述

1.1 植物对碳氮吸收的调节

1.2 NDH-1复合体调节碳代谢

1.3 PII蛋白的结构与功能

1.4 NDH-1复合体对PII蛋白的影响

1.5 本论文研究的目的和意义

第2章 材料方法

2.1 实验材料

2.2 方法

第3章 结果与分析

3.1 PII突变株及过表达株的构建及鉴定

3.2 PII的缺失增加了NDH-1的活性

3.3 PII的缺失增加了NDH-CET活性

3.4 PII的缺失增加了NDH-1依赖的呼吸活性

3.5 ndhV的敲除损伤了ΔPII中NDH-CET活性

3.6 ndhD2的敲除增加了ΔPII中NDH-1依赖的呼吸活性

3.7 PII的缺失显著增加了细胞中ROS含量

3.8 NDH-1活性增加降低ΔPII中ROS含量

第4章 讨论

第5章 结论

参考文献

致谢

声明