捻转血矛线虫透明质酸酶鉴定及其功能的初步研究

摘要

捻转血矛线虫会引起严重的牛羊寄生虫病，寄生于宿主真胃，造成幼畜死亡，带来严重的经济损失。目前捻转血矛线虫病的防控仍然是以药物预防为主，但线虫耐药问题的日益严重，迫切需要探索新的防控措施和干预靶点。捻转血矛线虫经历自由生活阶段和寄生阶段，感染期幼虫为三期幼虫(L3)，当L3幼虫经口感染宿主后，约3天到达皱胃，然后钻入皱胃黏膜下发育至四期幼虫(L4)后再钻出黏膜定植于皱胃表面发育至成虫。钻入胃黏膜下方是捻转血矛线虫入侵过程中的重要环节。透明质酸酶(HAase)能够降解胞外黏多糖透明质酸，钩虫相关的研究表明在入侵过程中发挥了作用，而且体外培养捻转血矛线虫时，在L3幼虫发育至L4幼虫的早期过程中，能够向体外释放透明质酸酶水解透明质酸。本实验室前期的研究工作表明，辐照后捻转血矛线虫的成虫发育率降低，且下调透明质酸酶基因的表达。因此推测，透明质酸酶的表达量与捻转血矛线虫的毒力存在联系。基于此开展了捻转血矛线虫透明质酸酶功能的初步研究工作。 首先根据公布在GenBank上的捻转血矛线虫透明质酸酶的全基因序列，分析表明透明质酸酶基因编码511个氨基酸，理论分子量为57kD，利用signalP预测显示存在信号肽。PCR扩增目的基因序列，经双酶切、测序鉴定后转化至大肠杆菌中进行原核表达并通过Western blot分析其免疫原性;通过免疫组化的方法鉴定透明质酸酶在捻转血矛线虫L3幼虫中的分布情况;最后用RNA干扰技术，针对透明质酸酶基因设计并合成特异性siRNA，通过电转方式将siRNA导入捻转血矛线虫感染性L3幼虫体内，利用实时荧光定量PCR分析透明质酸酶基因在L3幼虫中的转录抑制效果;将透明质酸酶特异性siRNA电转导入L3幼虫24h后感染绵羊皱胃外植体，检测透明质酸酶基因沉默后虫体对皱胃组织的侵入率，并且对L3幼虫入侵后的皱胃外植体进行组织切片观察;同时将透明质酸酶特异性siRNA电转导入L3幼虫24h后感染绵羊，定期采集绵羊粪便检查虫卵数，第35d后剖检绵羊皱胃，检查荷虫数以及成虫形态及体表损伤。 初步结果表明:western-bolt结果表明重组HC-HAase有良好的免疫原性，而且免疫组化结果显示HAase在虫体中主要分布于头部，为证明该酶在入侵时发挥重要作用提供有效依据;电转24h后实时荧光定量PCR检测捻转血矛线虫L3幼虫透明质酸酶基因的表达量，试验组中透明质酸酶基因的相对表达量显著低于对照组(p＜0.05)，通过电转法将透明质酸酶基因特异性siRNA导入脱鞘捻转血矛线虫L3幼虫后能有效降低透明质酸酶的酶活性单位。体外实验结果表明将透明质酸酶基因干扰后捻转血矛线虫L3幼虫对胃组织外植体的入侵率为9.45％，而对照组为53.62％。动物体内实验结果表明脱鞘捻转血矛线虫L3幼虫经过siRNA干扰后感染绵羊18-32天检测粪便中虫卵数量，干扰组绵羊的每克粪便虫卵数明显低于对照组;35天后剖检皱胃内成虫数，对照组虫体定植率为77.1％，实验组为39.7％，且两组存在显著差异(P＜0.01);捻转血矛线虫L3幼虫可能通过分泌透明质酸酶分解宿主黏膜组织，有利于虫体侵入宿主黏膜，进而促进虫体在宿主黏膜中的定植。透明质酸酶作为捻转血矛线虫入侵时的关键毒力因子，其功能性研究，有利于对捻转血矛线虫病的防治。

目录

摘要

英文缩略表

1．1捻转血矛线虫病

1．1．1捻转血矛线虫简介

1．1．2捻转血矛线虫病的防治

1．1．3捻转血矛线虫疫苗的研究进展

1．2透明质酸酶的发展及功能

1．3 RNA干扰原理与应用

1．3．1RNA干扰的发展史

1．4毒力因子

第2章捻转血矛线虫透明质酸酶基因RNA干扰实验

2．1、材料与方法

2．1．1材料

2．2实验方法

2．2．1捻转血矛线虫三期幼虫的收集

2．2．2siRNA及引物序列设计

2．2．5干扰后H．contortus-HAase活性检测

2．3实验结果

2．3．2 Q-PCR检测基因的表达抑制情况

2．3．3干扰后H.contortus-HAase活性检测

2．4讨论

第3章HC-HAase的原核表达及其在虫体中的定位分析

3．1实验材料

3．1．1实验仪器及试剂

3．1．2实验动物

3．2实验方法

3．2．1 PCR扩增HC-HAase

3．2．2 HC-HAase在E.coli中的表达

3．2．3重组蛋白免疫原性分析

3．2．4免疫组化检测HC-HAase在虫体内的定位

3．3实验结果

3．4讨论

第4章捻转血矛线虫对离体胃组织的入侵研究

4．1实验材料

4．1．1实验仪器及试剂

4．1．2实验动物

4．1．3实验虫株

4．2实验方法

4．2．1胃组织体外感染L3幼虫及虫体计数

4．2．2虫体入侵后皱胃组织的病理切片观察

4．3结果

4．3．1胃组织体外感染L3幼虫及虫体计数

4．3．2虫体入侵后皱胃组织切片观察

4．4讨论

第5章捻转血矛线虫透明质酸酶RNAi在体动物实验

5．1实验材料

5．1．1实验仪器及主要试剂

5．1．2实验动物

5．1．3实验虫株

5．2实验方法

5．2．1实验虫株的收集

5．2．2捻转血矛线虫在宿主体内的定植

5．2．3成虫外形观察

5．2．4扫描电镜观察成虫体表特征

5．3实验结果

5．4讨论

第6章全文总结

参考文献

致谢

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