菠菜硝酸盐转运蛋白基因的克隆与功能分析

摘要

硝态氮(NO3--N)是菠菜最重要的氮素营养之一，与菠菜的生长发育、形态建成、产量品质密切相关。硝酸盐转运蛋白参与植物对硝态氮的主动吸收和体内运转，在植物根系吸收和体内分配中发挥重要作用。研究菠菜硝酸盐转运蛋白及其生物学功能对于改良菠菜氮素吸收和转运能力、降低硝酸盐积累及提高氮素利用效率有重要指导意义。本文以菠菜材料SP4为研究材料，克隆了5个菠菜硝酸盐转运蛋白基因SoNRT1.3、SoNRT1.5、SoNRT1.9、SoNRT2、SoNRT3，进行了其编码蛋白的生物信息学分析及不同硝态氮浓度处理下的时间表达模式分析，并利用亚细胞定位及遗传转化拟南芥研究了5个硝酸盐转运蛋白的生物学功能，主要研究结果如下: 1.以菠菜SP4为材料，克隆得到了5个硝酸盐转运蛋白基因SoNRT1.3、SoNRT1.5、SoNRT1.9、SoNRT2和SoNRT3，序列分析结果表明SoNRT1.3、SoNRT1.5、SoNRT1.9、SoNRT2基因含有MFS保守序列，其氨基酸序列与拟南芥NRTs同源性较高;SoNRT1.3、SoNRT1.5、SoNRT1.9、SoNRT2和SoNRT3二级结构主要由α-螺旋和不规则卷曲构成;除SoNRT3有两个跨膜域外，其他基因编码的蛋白质均含有12个跨膜域。实时定量PCR分析结果发现SoNRT1.3、SoNRT3主要在根中表达，SoNRT1.5、SoNRT1.9、SoNRT2，在根和地上部分均具有相当的表达水平。缺氮和供氮均不同程度诱导五个基因在叶片、叶柄和根中的表达。根中SoNRT1.3、SoNRT1.5显著受供氮诱导，SoNRT1.9、SoNRT3和SoNRT2在根中明显受缺氮诱导且SoNRT3和SoNRT2表达谱相似。 2.采用农杆菌侵染烟草瞬时表达法进行基因的亚细胞定位研究，发现SoNRT1.3和SoNRT2定位于细胞膜上，说明两者可能具有介导离子运转的功能。对得到的5个基因的T2代拟南芥进行表达分析发现，5个SoNRT基因在低、高硝态氮处理条件下均奄表达。SoNRT1.3、SoNRT1.5、SoNRT1.9、SoNRT、SoNRT3基因表达水平受不同硝态氮浓度诱导，组织间差异明显。SoNRT1.3、SoNRT1.5主要在地上部分表达;SoNRT1.9、SoNRT2和SoNRT3在根和地上部分均有表达。部分株系表达谱与菠菜类似。除SoNRT1.3-3株系外，低氮处理下各转基因株系的地上部分鲜重均显著高于野生型，增加约2倍，过表达SoNRT1.5-7同时显著提高了拟南芥地上部分总氮含量。高氮处理仅显著提高了转SoNRT3-7植株的鲜重。在鲜重和总氮增加或不变的情况下，转基因拟南芥株系SoNRT1.3-3、SoNRT1.5-7、SoNRT1.9-1、SoNRT3-7硝态氮含量反而显著降低，可为菠菜品质育种降低硝酸盐积累量提供候选基因。

目录

摘要

1．1研究背景与意义

1．2菠菜氮素营养研究进展

1．3．植物NRT研究进展

1．3．1植物NRT蛋白结构

1．3．2植物NRT生理功能

1．3．3植物NRT基因的表达调控

1．4研究目的及意义

1．4．1研究目的

1．4．2研究意义

2．1．试验材料

2．1．1植物材料

2．1．2菌株及质粒载体

2．1．3试剂及试剂盒

2．2试验方法

2．2．1菠菜NRT基因序列的获得

2．2．2 DNA提取

2．2．3 RNA提取

2．2．4 cDNA合成

2．2．5基因CDS全长克隆

2．2．6全长克隆载体构建

2．2．7生物信息学分析

2．2．8硝酸盐处理与实时荧光定量qRT-PCR分析

2．2．9构建亚细胞定位重组载体

2．2．10感受态农杆菌的制备

2．2．11转化农杆菌

2．2．12浸染烟草表皮细胞

2．2．13植物表达载体构建

2．2．14转化拟南芥

2．2．15转基因植株阳性鉴定

2．2．16转基因拟南芥表型及生理指标测定

2．3数据统计分析

3结果与分析

3．1菠菜NRT基因全长的克隆

3．1．1菠菜NRT基因全长的获得

3．2菠菜NRT基因家族分析

3．2．1菠菜NRT基因全长的序列分析

3．2．2菠菜NRT基因蛋白结构预测

3．2．3菠菜NRT基因编码蛋白跨膜结构分析

3．2．4菠菜NRT基因编码蛋白二级结构预测

3．2．5菠菜NRT基因系统进化树分析

3．2．6菠菜NRT基因表达分析

3．3亚细胞定位

3．4转基因拟南芥植株的鉴定

3．5转基因拟南芥基因表达分析

3．6转基因拟南芥生长及生理指标分析

3．6．1生物量比较

3．6．2总氮含量比较

3．6．3硝态氮含量比较

4讨论

5．1总结

5．2展望

参考文献

攻读硕士期间的科研成果

致谢

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