胶体金免疫层析法快速检验醋酸甲孕酮

摘要

醋酸甲孕酮（Medroxyprogesterone Acetate，MPA）是一种人工合成的激素，在畜牧生产中，曾被用作动物生长促进剂。由于醋酸甲孕酮有致乳腺癌的作用，我国和欧盟已禁止在动物性食品生产中使用该药物。目前检测醋酸甲孕酮的方法主要有色谱法和ELISA法，但这些方法操作复杂，需要专门的仪器设备，不适合在现场进行快速检测。本研究旨在应用胶体金免疫层析原理，研制醋酸甲孕酮快速诊断试纸条。 本文采用0-（羧甲基）羟胺法合成醋酸甲孕酮-3-(O-羧甲基)肟，琥珀酸酐法合成琥珀酰甲孕酮。研究发现，琥珀酰甲孕酮的合成需要24小时高温回流，且生成的产物量少；醋酸甲孕酮-3-(O-羧甲基)肟的合成只需在室温下搅拌3小时，且生成的产物量多。采用混合酸酐法和EDC法分别将醋酸甲孕酮-3-(O-羧甲基)肟与KLH和BSA偶联合成人工完全免疫原和包被抗原，紫外分光光度计鉴定表明偶联成功，并测得偶联比分别为2029:1和43:1。用MPS－KLH免疫三只新西兰家兔，获得抗MPA多克隆抗体，亲和纯化后，间接ELISA测定效价达到1：64000。采用竞争ELISA测定抗体与MPA的亲和性，结果表明MPA能与所得抗体特异性反应，且竞争性抑制结果明显。 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，结果表明，加入还原剂后最佳反应时间为6min，反应过程中搅拌速度为1000rpm。经过紫外分光光度计鉴定制备的金颗粒直径在40nm左右，满足试纸条检测的要求。用制备的胶体金标记MPA多克隆抗体，经过紫外分光光度计鉴定发现胶体金最大吸收峰波长在标记前后发生移位，表明标记成功。将MPA金标抗体包被在胶体金结合垫上，MPS-BSA抗原和羊抗兔IgG二抗包被在硝酸纤维膜上，其中MPS-BSA作为检测线，羊抗兔IgG二抗作为质控线，制备醋酸甲孕酮快速检测试纸条。 通过方阵实验对金标抗体浓度和抗原浓度进行了优化，结果表明：当采用Millipore公司型号为M135的硝酸纤维膜，抗原、MPA金标抗体浓度分别为1mg/mL和0.5μg /mL时，其检测灵敏度为0.1μg /mL。