假单胞菌株M18中rhl菌群传感系统和调控基因pltR的鉴定及功能研究

摘要

荧光假单胞菌(Pseudomonas sp.M18)是从上海郊区甜瓜根际分离筛选到的一株具有生物防治功能的假单胞菌新种。M18生防作用主要归功于其可分泌多个抗生物质,包括藤黄绿菌素(pyoluteorin,Plt)和吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)等。本研究试图在分子水平上鉴定藤黄绿菌素合成相关的生物调控因子,揭示和阐明这些调控因子和藤黄绿菌素生物合成之间的关系。并以这些调控因子为靶向,构建Plt高产工程菌株,提高M18的Plt产量,增强其生物防治能力。本研究主要包括四个方面内容:
　　 第一方面,本课题组利用双元报告转座子mini-Tn5 lacZ-ter/1,筛选了若干后期菌群传感应答基因突变株。与野生型菌株相比,M46-11、M49-2和M58-17的表型具有显著变化,它们分别具有Plt不产、涌动能力降低和红色素合成能力缺失的特征。利用分子生物学的方法,鉴定和分析了相应的突变基因,证实M58-17为潜在的菌群传感突变株。研究过程中还发现,M18菌株能够分泌高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactones,AHLs),其降解(M18/pME6863)或缺失(M58-17)均可以影响抗生素的产量,从而推测AHL类型菌群传感系统存在于该菌株中,并且可能介入了抗生素生物合成的调控体系。
　　 第二方面,生物信息学分析显示,藤黄绿菌素生物合成基因簇启动子区域存在一个潜在的LuxR家族蛋白作用位点(lux box),表明M18菌株中潜在的菌群传感(quorum sensing QS)系统可能直接参与了Plt生物合成的调控。基于以往遗传学分析和突变株58-17突变基因序列分析表明,假单胞菌株M18兼有荧光假单胞和铜绿假单胞菌的遗传学背景,并且部分的rhl1/基因序列十分相似(相似度99％)。据此设计保守引物,扩增得到M18菌株中的rhlR和rhl1基因。序列分析结果显示,rhlR和rhl1基因及表达蛋白质序列与铜绿假单胞PAO1(Pseudomonas aeruginosaPAO1)高度相似。因此,M18菌株中的这个菌群传感系统也命名为rhl菌群传感系统(RhlR and RhlI)。
　　 庆大霉素抗性基因(Gm)插入突变株M18IG(rhlI：Gm)丧失了合成N-butyryl-homoserine lactone(BHL)和N-hexanoyl-homoserine lactone(HHL)这两种AHL信号分子的能力,但其Plt产量比野生型提高了5倍,同时抑制另一个抗生物质PCA的生物合成。卡那抗性基因(Km)插入失活rhlR基因后得到突变株M18RK(rhlR：Km),其Plt和PCA合成变化趋势与突变株M18IG相似。藤黄绿菌素pltLA’-‘lacZ翻译融合和吩嗪-1-羧酸phzA’-‘lacZ翻译融合在突变株中的表达情况表明,rhlI和rhlR在基因表达水平上调控这两种抗生素的生物合成。RhlR和RhlI组成一个有机统一的rhl菌群传感系统,参与调控Plt和PCA生物合成。随后的信号分子添加实验又证明,BHL信号分子而非HHL在该调控中发挥了主导作用。
　　 野生型菌株M18,突变株M18IG和M18RK中pltA基因的mRNA荧光定量PCR分析结果显示,突变菌株中pltA基因的mRNA水平是野生型的4至5倍。这表明rhl菌群传感系统负调控Plt生物合成基因簇的转录。rhl菌群传感系统突变菌株中,plt转录融合表达质粒pMEAZ-12的表达水平也提高了将近5倍。与此形成鲜明对比的是,另一plt转录融合表达质粒pMEAZ-13在rhl菌群传感系统突变菌株中的表达水平却和野生型菌株一致。这两个转录融合表达质粒的区别在于pMEAZ-13比pMEAZ-12少了启动子和基因编码区之间的176 bp间隔序列。这些结果进一步证明了rhl菌群传感系统在转录水平上负调控Plt的生物合成；另一方面也表明,176 bp的间隔序列是调控相关的重要位点。同时也揭示潜在的lux box在此调控过程中并不发挥所预测的生物学功能。
　　 同时,rhl菌群传感系统的突变(M18IG和M18RK)促进了ABC(ATP-bindingcassette)转运基因簇pltHIJKNO的表达,而后者负责转运分泌Plt而促进Plt的产生。rhlI pltB双突变菌株M18TI和rhlR pltB双突变菌株M18TR不再合成Plt,转运基因簇pltHIJKNO在这两双突变菌株中的表达又显著降低,只有野生型水平的一半。这些结果表明rhl菌群传感系统必须以Plt为媒介,从而负调控转运基因簇pltHIJKNO的表达。
　　 第三方面,在Plt生物合成基因簇上游鉴定了一个Plt生物合成正调控因子编码基因pltR。pltR突变株M18TRG和pltR过表达菌株M18(pME6032PLTR)中Plt、PCA的产量以及Plt生物合成基因簇的转录结果表明,pltR在转录水平上对Plt的生物合成进行路径特异性的正调控。在rhl菌群传感系统突变株M18IG和M18RK中,pltR’-‘lacZ翻译融合表达增加,表明PltR表达受rhl菌群传感系统负调控,从而后者对藤黄绿菌素生物合成进行负调控。
　　 此外,pltR’-‘lacZ翻译融合在不同突变株中的差异性表达表明PltR处于Plt生物合成调控体系下游,其介导了GacA/GacS对Plt生物合成的正调控作用,但不介入RsmA对Plt生物合成的负调控作用。Plt本身也不影响pltR基因的表达。
　　 第四方面,在研究藤黄绿菌素和吩嗪-1-羧酸二者生物合成的相互关系时发现,吩嗪-1-羧酸的生物合成在转录后水平上抑制了藤黄绿菌素的产生；而后者对前者没有调控作用。不产生PCA的突变菌株M18P中添加过量PCA,并没有逆转其Plt高产的特点,从而证明了PCA分子本身不是Plt生物合成的抑制物。PCA生物合成的丧失所导致的Plt高产并不是PCA的缺失所致,而是另有它因。RT-PCA和转录融合表达实验又证明,与rhl菌群传感不同,PCA生物合成对Plt的正调控作用发生在转录后水平上,而不是转录水平上。

目录

文摘

英文文摘

上海交通大学学位论文答辩决议书

第一章 文献综述

1.1 假单胞菌简介

1.1.1 病原性假单胞菌

1.1.2 生防假单胞菌

1.1.3 生物降解假单胞菌

1.2 抗生素简介

1.3 假单胞菌生防机制

1.3.1 分泌抗生素

1.3.2 分泌铁载体

1.3.3 根际定殖与竞争

1.3.4 系统抗性的诱导

1.4 菌群传感

1.4.1 菌群传感简介

1.4.2 革兰氏阴性细菌中的菌群传感

1.4.3 革兰氏阳性细菌中的菌群传感

1.4.4 菌群传感网络结构

1.5 细菌调控蛋白LysR家族

1.6 研究目标、内容及意义

1.6.1 研究目标与内容

1.6.2 研究意义

第二章 材料和方法

2.1 培养基

2.2 菌株培养和保藏条件

2.3 抗生素的使用

2.4 DNA常规操作技术

2.5 Plt和PCA的定量分析

2.6 β-半乳糖苷酶活性的测定

2.7 大肠杆菌和假单胞菌感受态细胞的制备

2.8 DNA-DNA放射性杂交

2.9 假单胞菌和大肠杆菌高效接合转移方法

第三章 假单胞菌M18后期菌群传感应答基因突变株58-17筛选及AHLs信号分子初探

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌株与质粒

3.2.2 富含信号分子培养物基的制备

3.3 结果与分析

3.3.1 后期表达基因的筛选原理

3.3.2 后期基因突变株的筛选

3.3.3 后期基因突变株的分类

3.3.4 突变基因序列分析

3.3.5 M18培养物中信号分子初探

3.3.6 高丝氨酸内酯信号分子与抗生素合成的关系初探

3.4 讨论

第四章 假单胞菌M18中rhl菌群传感系统的鉴定及功能研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌株与质粒

4.2.2 高丝氨酸内酯信号分子的提取

4.2.3 高丝氨酸内酯的生物学检测

4.2.4 假单胞菌株M18 rhll突变株和rhlR突变株的构建

4.2.5 互补菌株的构建

4.2.6 RNA的提取和反转录

4.2.7 Real-time PCR操作和计算方法.........

4.3 结果和讨论

4.3.1 rhll突变对AHLs合成和色素产生的的影响

4.3.2 rhl菌群传感系统对Plt合成的影响

4.3.3 rhl菌群传感系统对pltA表达的影响发生在转录水平上

4.3.4 信号分子BHL和HHL对Plt产量的区别性调控作用

4.3.5 依赖于Plt,rhl菌群传感系统负调控Plt特异性ABC转运系统

4.3.6 rhl菌群传感系统菌株M18的生长的影响

4.3.7 菌株M18中rhl菌群传感系统对PCA合成的影响

4.4 小结

第五章 假单胞菌M18中Plt生物合成路径特异性正调控基因pltR的鉴定及功能研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌株和质粒

5.2.2 pltR基因的PCR和序列分析

5.3 结果与分析

5.3.1 pltR的同源性分析

5.3.2 M18 pltR突变株M18TRG及反式互补菌株的构建

5.3.3 pltR基因突变阻抑Plt的合成

5.3.4 pltR过表达菌株的构建和对Plt的产生促进作用

5.3.5 pltR翻译融合表达质粒的构建

5.3.6 PltR调控因子在转录水平上促进Plt合成基因簇的表达

5.3.7 Plt分子缺失,gacA和rsmA基因突变对pltR基因表达的影响

5.3.8 PltR介导了rhl菌群传感系统对Plt生物合成的负调控作用

5.4 讨论

第六章 PCA和Plt生物合成的相互凋控作用

6.1 前言

6.2 菌株和质粒

6.3 实验结果

6.3.1 PCA生物合成的抑制促进Plt的生物合成

6.3.2 PCA分子本生不参与对Plt生物合成的调控

6.3.3 Plt生物合成基因簇在菌株M18和突变株M18P中的表达水平

6.4 讨论

第七章 总结

本文的主要创新点

参考文献

致谢

攻读博士学位期间论文(待)发表情况和所获奖励