人巨细胞病毒潜伏激活诊断试剂盒的研制和相关研究

摘要

目的:制备人巨细胞病毒pp65抗原血症检测试剂盒，并对pp65蛋白在外周血白细胞内的定位及意义进行探讨。建立检测HCMV pp65抗体的间接ELISA方法。 方法:以重组表达的HCMV pp65蛋白为抗原，运用杂交瘤技术制备单抗，对筛选获得的单抗进行鉴定，并以间接免疫荧光法与进口同类产品进行比较；将自制小鼠IgG免疫家兔获得的二抗进行标记，获得完整的检测试剂盒，以间接免疫荧光法与进口同类产品进行比较；通过DAPI染色、间接免疫荧光法和共聚焦显微镜扫描三者结果共同确定HCMV pp65 蛋白在细胞中的定位，并对部分移植患者进行动态跟踪；以重组表达蛋白HCMV pp65为抗原，建立间接ELISA法检测其特异性IgG型抗体，并对不同人群的检测结果进行分析。 结果:获得3株针对HCMV pp65蛋白的单抗，即B6、G12、2B12；Ig亚型依次为IgG1k型、IgG1k型、IgMk型；亲合常数依次为3.6×107L/mol、3.8×107L/mol、3.1×108 L/mol。免疫印迹试验结果表明3株单抗都与HCMV pp65蛋白特异性的结合，除2B12外，B6、G12与EBV、HSV 1、HSV 2均无交叉反应；与进口单抗平行检测140份临床标本，结果一致。与自行标记异硫氰酸荧光素的二抗配套检测HCMV pp65抗原，并以免疫荧光检测法与进口同类产品进行比较，通过与进口同类试剂盒平行检测16份临床标本，结果一致；结合DAPI染色、间接免疫荧光法和共聚焦显微镜扫描结果，发现阳性细胞有胞浆阳性、胞核阳性和核浆阳性3种表现形式，对于胞核阳性的细胞，pp65蛋白主要定位在细胞核内，非核膜部分；间接ELISA法检测HCMV pp65-IgG的最佳包被抗原浓度为10ng/孔，酶标二抗的工作浓度为1:3000。当阳性判断值A为0.298时，87份不同组的血清标本（HCMV感染活动组、HCMV感染不活动组、HCMV未感染组）阳性检出率分别为51.6％、12.1％和0。三组两两间均存在显著性差异（P<0.01）。 结论:自制检测试剂盒能够识别HCMV pp65抗原，为HCMV pp65抗原血症国产化检测试剂盒的研制奠定了基础；初步确定HCMV pp65蛋白在外周血白细胞的内的分布，同时结合阳性细胞的数量动态跟踪检测结果可能更有意义，但是还需要更多临床样本来明确；建立了检测HCMV pp65 IgG抗体的间接ELISA方法，应用本方法能从相应人群中检出该抗体，无假阳性存在，并与抗HCMV IgM的检出率有关。