化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA防治肝纤维化的实验研究

摘要

目的：①针对大鼠金属蛋白酶组织抑制剂.2rnRNA序列设计和筛选化学合成经修饰抗TIMP-2小分子干扰RNA；②研究化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA对肝星状细胞合成分泌细胞外基质的影响；③研究TIMP-2基质金属蛋白酶.2和膜型基质金属蛋白酶-1在活化HSCs中的表达及对ECM合成分泌的影响；④研究化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA对四氯化碳诱导和胆总管结扎大鼠肝纤维化模型的影响. 方法：①以胶原酶和链酶蛋白酶E原位灌流梯度离心法分离纯化HSCs；②以不同浓度和在不同时间点将化学合成经修饰抗TIMP-2siRNA转染活化HSCs,筛选基因沉默效率较高的一对；③检测抗TIMP-2siRNA对大鼠HSCs活化增殖、合成分泌ECM等生物学特性的影响；④检测抗TIMP-2 siRNA对HSCs合成分泌MMP-2、MTl-MMP和MMP-13水平的变化；⑤将筛选出一对化学合成抗TIMP-2 siRNA分别导入CCl<,4>诱导和胆总管结扎两种肝纤维化动物模型；⑥检测肝功能、血清纤维化标志物和肝组织羟脯氨酸含量、HSCs活化指标、ECM合成与降解指标和肝细胞增殖指标,评价其对大鼠肝纤维化的影响. 结论：①化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA能够高效抑制TIMP-2的表达,减少HSCs分泌合成ECM,抑制HSCs活化；②TIMP-2通过MTl-MMP介导MMP-2的活化；抑制TIMP-2的表达,MTl-MMP和MMP-2的表达随之降低,而HSCs合成分泌ECM也相应减少；③在CCl<,4>诱导的肝纤维化动物模型中,化学合成经修饰siRNA高效沉默TIMP-2基因的表达,可以促进ECM的降解,抑制HSCs的活化,增强肝细胞的再生；④在胆总管结扎肝纤维化动物模型中,化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA能够抑制胆总管结扎大鼠肝纤维化形成,有可能成为肝纤维化治疗的新策略.

目录

文摘

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前言

第一章化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA对活化HSCs合成分泌ECM的影响

1.1材料与方法

1.1.1材料

1.1.2方法

1.2结果

1.2.1 HSCs形态观察及鉴定

1.2.2两对化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA对HSCs活力的影响

1.2.3细胞总RNA电泳

1.2.4不同浓度和不同时间点化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA对HSCs中TIMP-2表达的影响

1.2.5化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA对HSCs中α-SMA、COLⅠ和COLⅢ mRNA表达的影响

1.2.6各组培养细胞上清液HA、PCⅢ和Hyp的含量

1.3讨论

第二章TIMP-2、MMP-2和MT1-MMP在活化HSCS中的表达及对ECM合成分泌的影响

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果

2.2.1化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA对HSCs中TIMP-2、MMP-2、MT1-MMP、MMP-13、COLⅠ和COLⅢmRNA表达的影响

2.2.2化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA对HSCs中TIMP-2、MTl-MMP、MMP-13和MMP-2 蛋白表达的影响

2.2.3各组HSCs培养上清液中HA、PCⅢ和Hyp的含量

2.3讨论

第三章化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA对CCL4诱导肝纤维化动物模型的影响

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果

3.2.1动物一般情况

3.2.2化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA对病理形态学的改变

3.2.3化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA对PVP、ALT、AST和Hyp的影响

3.2.4化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA对HA、LN、PCⅢ和COLⅣ的影响

3.2.5化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA对TIMP-2、COLⅠ、COLⅢ和α-SMAmRNA表达的影响

3.2.6化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA对TIMP-2、MMP-2和α-SMA蛋白表达的影响

3.2.7化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA在体内对肝细胞增殖的影响

3.2.8化学合成经修饰抗TIM-2 siRNA在体内对肝脏超微结构的影响

3.3讨论

第四章化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA抑制胆总管结扎大鼠肝纤维化形成

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果

4.2.1化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA减轻肝脏损伤

4.2.2化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA降低PVP、ALT、AST和Hyp水平

4.2.3化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA减少TIMP-2、COLⅠ和COLⅢ mRNA的表达

4.2.4化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA减少TIMP-2、α-SMA和desmin蛋白的表达

4.3讨论

结论

参考文献

致谢

siRNAs在基因治疗中的应用

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