促红细胞生成素促培养视网膜神经细胞轴突生长及其拮抗谷氨酸兴奋毒性作用的研究

摘要

一．原代视网膜神经细胞的混合培养 目的：建立原代视网膜神经细胞混合培养的方法。 方法：取生后2-3天的SD大鼠视网膜组织，0.08％胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液（1～1.2×106个/ml），接种于涂以鼠尾胶原的培养板, 用含20％胎牛血清的DMEM培养液培养。取培养4天的细胞行神经元特异性烯醇酶（neurone specific enolase, NSE）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）免疫细胞化学染色，结合细胞形态学特征，鉴定神经细胞和胶质细胞，并分别计算各自阳性细胞的百分比。取培养48h,72h,96h的细胞行苏丹黑B染色，图像分析法测量细胞胞体直径和轴突长度；取培养96h的细胞用流式FITC-Annexin V/PI双标法检测培养视网膜神经细胞的凋亡情况。 结果：在鼠尾胶原上培养的视网膜神经细胞生长良好,部分细胞伸出突起。培养体系中， NSE染色阳性细胞数占(93.015±2.649)％， GFAP染色阳性细胞数占(1.920±0.074)％；培养视网膜神经细胞胞体直径和轴突长度随着培养时间的延长而逐渐增大增长；有血清培养的细胞早期凋亡率为(4.98±0.55)％，总凋亡率为（11.05±2.10）％，无血清培养细胞早期凋亡率为(14.63±1.24)％，总凋亡率为（21.62±3.14）％，两者比较差异均有显著性意义（P=0.002,0.049）； 结论：混合培养视网膜神经细胞中神经细胞纯度高，生长状态好，适合作为进一步实验研究的细胞模型。 二．促红细胞生成素促混合培养视网膜神经细胞轴突生长的作用 目的：观察促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）对培养视网膜神经细胞胞体直径和轴突长度的影响。 方法：用免疫细胞化学法检测培养视网膜细胞EPO和EPO受体（erythropoietin receptor,EPOR）的表达；在培养液中分别添加1.0U/ml、3.0 U/ml和6.0 U/ml的EPO培养细胞96小时后，予苏丹黑B染色,图像分析法测量各组培养视网膜神经细胞胞体直径和轴突长度。 结果：1.混合培养的视网膜神经细胞均有EPO和EPOR表达；2. EPO对视网膜神经细胞的胞体直径无明显影响（P>0.05）；3.培养视网膜神经细胞的轴突长度随着EPO浓度的升高而增长，呈剂量依赖性，EPO浓度为6.0 U/ml时，可达对照组的162.8％。 结论：一定浓度的EPO在体外短期内能够促进培养视网膜神经细胞的轴突生长。 三．促红细胞生成素促进谷氨酸毒性作用下混合培养视网膜神经细胞的存活 目的：观察EPO对谷氨酸毒性作用下培养的视网膜神经细胞存活和凋亡的影响。 方法：分别将0.3 U/ml、1.8 U/ml和3.0 U/ml的EPO作用于无血清培养的视网膜神经细胞18和36小时；或作用于无血清培养的视网膜神经细胞12小时后，再分别加入5mmol/L和10mmol/L谷氨酸溶液继续培养36小时后，用MTT法检测细胞的存活和流式FITC-Annexin V/PI双标法检测细胞凋亡。 结果：1.各浓度的EPO(0.3 U/ml、1.8 U/ml和3.0 U/ml)对无血清培养的视网膜神经细胞的存活(18小时P=0.815,0.998,0.521；36小时P=0.392,0.807,0.765)和凋亡(早期凋亡率P=0.814，0.772，0.913；晚期凋亡率P=0.391，0.567，0.598；总凋亡率P=0.582，0.567，0.724)均无影响。2. 谷氨酸浓度为5mmol/L时, 0.3 U/ml，1.8U/ml，3.0 U/mlEPO均能明显提高培养细胞的存活（P=0.039,0.023,0.001），减少培养神经细胞的早期凋亡率（P=0.006,0.000,0.000）；1.8U/ml和3.0U/mlEPO能减少培养神经细胞的总凋亡率(P=0.016,0.000)。谷氨酸浓度为10mmol/L时，3.0 U/mlEPO能明显提高培养细胞的存活(P=0.000)；1.8U/ml和3.0U/mlEPO能显著减少早期凋亡率(P=0.000,0.000)；3.0 U/mlEPO能显著减少培养神经细胞的总凋亡率（P=0.002）。 结论：EPO对无血清培养的视网膜神经细胞的存活和凋亡无影响，但能促进谷氨酸兴奋毒性作用下培养的视网膜神经细胞的存活。