高苯丙氨酸对神经元胞浆游离钙的影响机制研究

摘要

苯丙酮尿症是一种能导致儿童智力发育落后的遗传代谢性疾病,苯丙氨酸及其代谢产物在体内蓄积是苯丙酮尿症患者脑损伤的根本原因,但其导致脑损伤的确切机理不清楚.此外苯丙氨酸所致的脑损伤是一个很好的化学性脑损伤临床模型,揭示其发病机制,不仅有助于苯丙酮尿症的防治,更能够对神经损伤的保护和再生研究提供启迪.本课题主要研究苯丙氨酸及其衍生物对胚鼠皮层神经元胞浆游离钙的影响及其相关机制探索. 本课题组在基因芯片中发现高苯丙氨酸诱导可以增加calmodulinI、Ca<'2+>/calmodulin-dependent protein kinase、L型Ca<'2+>channel的基因表达,降低calmodulinⅡ、calcineurin、plasma membrane Ca<'2+>-ATPase 2b和2a的基因表达,而这些基因的表达和胞浆游离钙密切相关,所以推测钙可能参与了高苯丙氨酸诱导的脑损伤.为了验证这个假设,本研究用共聚焦显微镜动态观测高苯丙氨酸及其衍生物对神经元胞浆游离钙的影响.在体外培养的胚鼠大脑皮层神经元模型中,加入高浓度的苯丙氨酸(0.9mM)及其衍生物苯乳酸(0.5mM)均不同程度的降低胞浆游离钙,而加入苯乙酸(1.1mM.)后胞浆游离钙先升高,3分钟以后开始下降.能导致胞浆游离钙降低的疾病并不多见,所以本研究有必要探讨相关机制.用EGTA+无钙液代替标准细胞外液,同不加苯丙氨酸的样本相比,加入苯丙氨酸的样本胞浆游离钙明显降低,说明苯丙氨酸可以增加钙离子外流；这种外流可以被细胞膜钙泵(PMCA)非特异的抑制剂vanadate阻断,而不能被钠钙交换体(NCX)特异性抑制剂KBR7943和内质网(肌浆网)钙转运体(SERCA)特异性抑制剂thapsigargin阻断,提示苯丙氨酸可能通过PMCA降低胞浆游离钙.液闪仪测定苯丙氨酸诱导的细胞膜钙转运能力增强和PMCA酶活性增高证实了这个结论.Vanadate在抑制PMCA的同时也可以抑制SERCA,所以我们用特异的siRNA抑制PMCA,结果和vanadate相似. 高浓度苯丙氨酸介导的脑损伤是一个慢性的长期的过程.在本研究中,我们用苯丙氨酸诱导神经元2周,在第3d、7d、9d、14d共聚焦显微镜观察胞浆游离钙的水平,同时用液闪仪检测PMCA钙摄取能力和ATP酶水解法测定PMCA酶活性.结果发现PMCA酶活性和PMCA钙摄取能力在第9d的时候开始下降,有意义的是胞浆游离钙水平在第9d也开始下降. 钙超载是公认的神经元损伤的诸多复杂机制之一,本研究发现高浓度苯丙氨酸短期诱导降低胞浆游离钙,而诱导9天以后升高胞浆游离钙,于之相对应的PMCA酶活性和钙摄取能力也从9天前的升高而转为降低,我们推测这可能是苯丙氨酸诱导早期PMCA适应性活性升高继之失代偿导致胞浆钙稳态失衡.PMCA 酶活性功能和胞浆钙离子稳态可能是苯丙氨酸所致的脑损伤的又一发病机制.

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引言

第一部分：共聚焦显微镜检测苯丙氨酸及其衍生物对神经元胞浆游离钙的影响

材料和方法

结果

讨论

第二部分苯丙氨酸降低神经元胞浆游离钙的机制研究

Ⅰ苯丙氨酸对神经元胞膜钙ATP酶活性的影响

材料和方法

结果

Ⅱ苯丙氨酸对神经元胞膜钙ATP酶钙摄取能力的影响

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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