CD11c髓样树突状细胞在慢性乙型 肝炎患者中数量和功能的变化

摘要

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是目前全球公共性问题，严重危害人民健康。既往研究表明慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者不能产生多克隆特异性辅助性T细胞1（T helper cell 1，Th1）和细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）反应，导致乙肝病毒不能被清除而形成长期感染。树突状细胞（dendritic cell，DC）作为专职抗原递呈细胞，在诱导特异T细胞反应中起非常重要的作用。多数研究认为，慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的免疫调节和抗原提呈功能存在表型、功能及细胞亚群比例等方面的异常，并且与HBV慢性持续感染密切相关。以往DC的研究多采用外周血单个核细胞体外诱导培养，然而单核细胞来源树突状细胞(monocyte-derived dendritic cells，moDC)在长期外源性刺激因子作用下有可能改变DC本身的免疫应答。根据DC的来源和表面标记以及功能，可将DC分为髓样树突状细胞(myeloid dendritic cell，mDC)和淋巴系来源的浆样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）。其中mDC前体即CD11c+髓样树突状细胞(CD11c+mDC）主要发挥抗原提呈的功能，促进Thl细胞极化和细胞免疫的发生，相对moDC更能体现出树突状细胞的免疫监视作用，在HBV感染慢性化机制中可能起着更重要作用。本研究探讨慢性乙型肝炎患者外周血中CD11c+髓样树突状细胞数量、表型和功能的变化，并且结合患者病毒载量、血清转氨酶以及肝脏炎症及纤维化程度等各项临床指标进行分析，进一步阐明HBV感染临床慢性化的免疫机制。 目的:本研究探讨慢性乙型肝炎患者外周血中CD11c+髓样树突状细胞(mDC)数量、表型和功能的变化，以及与HBV持续感染之间的关系。 方法:用淋巴细胞分离液分离获取外周血单个核细胞（PBMC），标记FITC(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56)、PE-CD11c+和APC-HLA DR单克隆抗体，流式细胞仪检测mDC(CD11c+和HLA DR双阳性细胞）在PBMC中的频数；用BDCA-1树突状细胞分选试剂盒从外周血单个核细胞中分离得到较高纯度的CD11c+ mDC，流式细胞仪检测新鲜分离mDC表面共刺激分子CD80、CD86表达；1.5×105 mDC在RPMI1640中培养，同时加入人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）、干扰素-γ、聚肌苷酸胞苷酸(PolyI:C)刺激mDC成熟，24小时后收集细胞上清液，检测细胞上清液中白介素-12（IL-12）浓度；以mDC为刺激细胞，CD4+ T细胞分离试剂盒分离外周血T细胞作为反应细胞，进行同种异体混合淋巴细胞反应（MLR），检测mDC对同种异体T淋巴细胞的增殖能力。 结果:与健康对照组相比，慢性乙肝患者CD11c+mDC占外周血单个核细胞（PBMC）的频数明显降低，差异有统计学意义（0.43％±0.55％ vs. 0.77％±0.56％，p<0.05）；慢性乙肝患者外周血mDC频数与血清谷丙转氨酶ALT水平呈负相关（r=-0.432，p<0.01），mDC频数与血清病毒载量呈负相关（r=-0.499，p<0.01）。对其中28名慢性乙型肝炎患者进行肝脏活检，不同肝脏炎症程度患者外周血mDC频数存在差异，轻度炎症组和中度炎症组分别低于无炎症/极轻度炎症组（p<0.05）；新鲜分离的mDC表面共刺激分子CD80、CD86表达率较低，但患者组CD86的表达明显高于正常对照组，差异有统计学意义（45.26％±21.54％ vs. 18.71％±10.93％，p<0.01）； 慢性乙型肝炎患者组分化成熟后的mDC在MLR中对同种异体T淋巴细胞的刺激能力低于健康对照组（p<0.05）；患者组mDC分泌IL-12的水平明显低于健康对照组为（42.35±16.17pg/ml vs. 161.92±84.49pg/mL，p< 0.01)。 结论:慢性乙型肝炎患者外周血CD11c+mDC亚群百分比降低，且外周血中mDC数量与血清ALT水平、病毒载量及肝脏炎症程度相关。外周血中新鲜分离的CD11c+mDC表面共刺激分子CD86表达率高于正常者，可能与mDC经HBV抗原攻击后部分活化致使细胞表型上调有关。慢性乙肝患者CD11c+mDC对同种异体T细胞的增殖能力及IL-12分泌水平低下。综上提示外周血中CD11c+ 髓样树突状细胞数量及功能的缺陷可能是乙肝病毒（HBV）持续感染的重要机制之一。