油脂代谢途径中两种脂肪酶的功能及磷脂酸信号调控研究

摘要

生物柴油作为柴油能源的可再生替代品，已经成为解决能源危机和环境污染的研究热点。在利用酶法催化合成生物柴油的研究中，尽管有一些脂肪酶可以有效催化生物柴油的合成，但仍然不能解决生物柴油生产成本高的问题，主要原因是在生物柴油生产中，脂肪酶的催化效率有限、热稳定性适中，以及原料成本占生物柴油总成本的60％-75％的问题，所以脂肪酶和原料油这两个关键因素造成了目前生物柴油生产的高成本。因此，研究脂肪酶的催化效率、热稳定性、以及在植物油脂生物合成途径中转录因子的调控以及被调控的网络，将有助于揭示脂肪酶结构与功能的关系以及植物油脂生物合成的调控机制，同时也为生物柴油产业化降低成本奠定重要的理论基础。 本研究通过对南极假丝酵母脂肪酶B的定点突变及性质研究、对液化沙雷氏菌脂肪酶(SLLipA)的克隆表达及性质研究、以及对拟南芥三个转录因子家族6个成员调控拟南芥种子油脂含量的研究和信号分子磷脂酸(PA)对这些转录因子的相互作用研究，得到了以下结果： 1)对CALB的三个氨基酸位点Asn292Tyr、Va1210Ile和Ala281Glu进行定点突变，并根据酵母偏爱密码子体外合成了突变的CALB(muCALB)基因和野生型CALB基因，然后分别整合到毕赤酵母GS115，获得分泌表达的重组脂肪酶菌株，筛选表达脂肪酶活力高的菌株，制备发酵生产曲线，结果表明在诱导表达48 h时，在细胞密度仅达到OD600=～7的状态下，脂肪酶的表达已经达到最高酶活力11 U mL-1。基于对CALB的计算机辅助的分子模型分析和疏水口袋的特征，设计合成了由4-aminobenzamidine和M-aminophenylboronic acid组成的亲和介质，用于CALB和muCALB的亲和纯化，这是首次采用具有高度特异性的仿生亲和纯化配体技术对CALB的纯化，电泳纯度达到99％。对纯化muCALB的水解性质进行研究，结果表明对底物对硝基苯酚酯的脂肪酸链长具有特异性，随着对硝基苯酚酯长链酰基的增加(C10-C18)，其水解活性相应从17.3 U mL-1降低至7.1 U mL-1，而野生型CALB水解该底物的特异性不明显。对muCALB粗酶的转酯化性质进行分析，结果表明在相同的温度条件下，反应24 h，muCALB催化大豆油转甲酯化的活力是CALB的2.3倍，尤其在55℃，muCALB催化活力最高达到3.02％，而CALB仅为0.98％，转化率是CALB的3.08倍。对muCALB热稳定性的研究表明，在85℃处理210 min后，muCALB残余酶活为20％，而野生型仅有2％的酶活，因此muCALB的耐高温稳定性增强。 2)采用染色体步移方法，成功从液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)株S33 DB-1中克隆了脂肪酶基因SLLipA，读码框含有1845bp，其核酸序列和编码的氨基酸序列与Serratia marcescens(Acc.No.DQ841349)具有74％的最高同源性；SLLipA具有脂肪酶特异活性位点Glyl-X1-Ser-X2-Gly，因此克隆的SLLipA属于脂肪酶GxSxG家族成员。将SLLipA ORF在异源宿主毕赤酵母GS115中成功表达，在含有甘油三酯的Rhodamine-Triglyceride-Agarose平板上筛选到活性高的菌株，用于研究SLLipA重组菌株的生长曲线，研究表明在甲醇诱导12 h后检测到脂肪酶活性，在48 h时酶活力最高达到16 U mL-1。对SLLipA酶学功能的分析表明，SLLipA具有底物特异性，最倾向于水解长碳链的ρ-NPS(C18)，其次是中碳链的ρ-NPM(C14)和ρ-NPL(C12)。对催化转甲酯的实验研究表明，SLLipA没有转甲酯活力，是一个水解类脂肪酶。 3)采用种子特异表达启动子Beta-Conglycinin，将植物中三个重要转录因子家族的6个转录因子在拟南芥种子中特异表达，这些转录因子包括Homeobox家族的GL2，MYB家族的WER(R2R3亚家族)、MYB家族中R3亚家族的MYB(At4G01060)、MYB(At2G30420)和GmMYB73，以及B3家族的FUS3。对GL2、WER、FUS3、MYB(At2G30420)和GmMYB73的转基因T1代种子的油含量分析结果表明，与野生型相比较，GL2、WER和GmMYB73影响了种子油的含量，而FUS3和MYB(At2G30420)没有影响种子油含量，因此推测GL2、WER和GmMYB73三个转录因子可能参与了植物脂质的生物合成调控，该研究为进一步揭示转录因子调控植物油质生物合成的机制奠定了一定的基础。 4)为研究转录因子WER、GL2、FUS3、MYB(At4G01060)和MYS(At2G30420)与脂质的相互作用，分别构建了这5个转录因子基因融合6XHis的pET28a(+)大肠杆菌表达载体，在大肠杆菌Roselta(DE3)中成功获得可溶性表达蛋白。利用Fatty western blot方法研究脂质PA、PC、PE，PG，PI，PS，LPC，LPA，diPA(18:1)，diPA(18:2)，diPA(16:0-18:1)，diPA(16:0-18:2)、DAG(8:0)、DAG(18:0-18:1)、DAG(2:0-18:1)与GL2、WER、FUS3、MYB(At4G01060)、MYB(At2G30420)蛋白的相互作用，研究结果表明只有磷脂酸(PA)及其特定类型PA，包括diPA(18:1)、diPA(18:2)、diPA(16:0-18:1)和 diPA(16:0-18:2)，与GL2和WER存在相互作用，而其它脂质与GL2和WER不存在相互作用。另外，转录因子FUS3、MYB(At4G01060)和 MYB(At2G30420)与所有脂质均不存在相互作用。因此，PA与GL2和WER之间存在特异性的相互作用。 5)利用SPR分子相互作用动态分析技术，以量化PA与WER之间相互作用的强度。对不同浓度WER与PA相互作用的分析结果表明，相互作用信号随着WER浓度的增加而增强，利用GraphPrism软件的非线性衰退程序分析了结合曲线的动力学参数，计算出相互作用的平均最适结合Kd值为1.76E-11(1/s)。 为了定位WER与PA之间相互作用的基序或结合的氨基酸位点，首先对WER进行了片段缺失，这些缺失片段包括WER(1-65)、WER(66-116)、WER(117-203)、WER(1-116)和WER(66-203)，将各片段构建到融合了6XHis的pET28a(+)大肠杆菌表达载体，在大肠杆菌Roselta(DE3)表达了可溶性蛋白。利用liposomal binding实验分析WER(1-65)、WER(117-203)、WER(1-116)和 WER(66-203)片段与PA的相互作用，结果显示只有WER(1-65)和WER(1-116)与PA存在结合。为了进一步验证liposomal binding的实验结果，采用SPR技术对纯化片段缺失蛋白WER(1-65)、WER(1-116)和 WER(66-203)与脂质体1PA(18:1)：3PC(18:1)进行分析，其结果与liposomal binding的实验结果一致。因此，揭示了WER与PA的结合基序位于片段WER(1-65)。 为了将WER与PA的结合定位在更小的范围，将WER(1-51)片段构建到融合了6XHis的pET28a(+)大肠杆菌表达载体，在大肠杆菌Roselta(DE3)中表达了可溶性蛋白。利用liposomal binding实验分析WER(1-51)与PA的相互作用，结果显示WER(1-51)与PA不存在相互作用。因此，基序(51KRCGKSCRLRWMNYL65)是PA与WER相互作用所不可缺少的，因而将PA与WER相互作用的范围缩小到该15个氨基酸的范围之内。 采用定点突变技术对WER进行氨基酸定点突变，突变位点包括单点突变(WERK41A，WERR52A，WERR58A或WERR60A)和双点突变(WERK51A+R52A或WERR58A+R60A)，将突变基因构建到融合了6XHis的pET28a(+)大肠杆菌表达载体，在大肠杆菌Roselta(DE3)中表达了可溶性蛋白。利用liposomal binding实验对6个突变蛋白与PA的相互作用进行了分析，结果显示与PA都不存在结合现象。为了进一步验证liposomalbinding的实验结果，采用SPR技术对纯化的WERK51A、WERR52A、WERR58A、WERK51A+R52A和WERR58A+R60A蛋白与脂质体1PA(18:1):3PC(18:1)进行互作分析，结果与liposomal binding的实验结果一致，除了对照WER外，这5个突变蛋白与脂质体均没有结合作用，因此，揭示了PA与WER相互作用所不可缺少的4个关键氨基酸位点K51A，R52A，R58A和R60A。该研究结果为进一步揭示PA与WER相互作用在植物中的调控功能奠定了重要的基础。 6)对拟南芥WER及其突变蛋白WERK51A+R52A和WERRS8A+R60A在烟草叶片中进行了亚细胞定位研究，结果显示野生型WER蛋白定位在细胞核中，但更集中分布在核仁区，而突变蛋白WERK51A+R52A和WERR58A+R60A只均匀地分布在细胞核中。该研究为揭示PA调控WER在细胞中的功能奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

声明

第一章文献综述

1.1引言

1.2脂肪酶的功能及分子改造研究

1.2.1脂肪酶概述

1.2.2脂肪酶的来源

1.2.3脂肪酶的分类

1.2.4脂肪酶催化反应机制

1.2.5脂肪酶催化反应及应用研究进展

1.2.6脂肪酶的分子改造研究

1.3植物油脂合成代谢的调控研究

1.3.1脂肪酸的生物合成

1.3.2油脂的生物合成

1.3.3植物油脂合成的调控研究

1.3.4磷脂酸调控转录因子的研究

1.3.5 PA作用于转录因子在油脂合成代谢调控中的研究现状

1.4脂肪酶功能及磷脂酸信号调控油脂合成研究的现状和意义

1.4.1脂肪酶功能及磷脂酸信号调控油脂合成的研究现状

1.4.2本研究的目的和意义

第二章材料和方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株和质粒

2.1.3主要实验设备

2.1.4试剂、酶及药品

2.2实验方法

2.2.1南极假丝酵母脂肪酶(CALB)的定点突变与性质分析

2.2.2液化沙雷氏菌脂肪酶(SLLipA)

2.2.3磷脂酸与转录因子WER、GL2的相互作用及其在拟南芥中功能的初步研究

第三章南极假假丝酵母脂肪酶B定点突变及酶学性质研究

3.1前言

3.2结果与分析

3.2.1 CALB和muCALB基因的合成及表达载体构建

3.2.2重组毕赤酵母脂肪酶的诱导表达

3.2.3重组表达脂肪酶的仿生亲和纯化

3.2.4 MuCALB的底物特异性分析

3.2.5 muCALB的转甲酯活性分析

3.2.6 MuCALB的热稳定性分析

3.3研究小结

第四章液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)S33 DB-1脂肪酶的基因克隆、异源重组表达及酶学性质分析

4.1前言

4.2结果与分析

4.2.1液化沙雷氏菌脂肪酶SLLipA基因的克隆与分析

4.2.2 SLLipA基因在毕赤酵母GS115中的重组表达

4.2.3重组表达蛋白SLLipA的纯化

4.2.4 SLLipA脂肪酶的性质分析活性

4.3研究小结

第五章磷脂酸与转录因子WER、GL2的相互作用及其在拟南芥中功能的初步研究

5.1 前言

5.2结果与分析

5.2.1转录因子在拟南芥种子中的特异表达研究

5.2.2磷脂酸与转录因子WER、GL2的相互作用研究

5.2.3磷脂酸与WER相互作用在拟南芥中功能的初步研究

5.3研究小结

第六章结论与展望

6.1研究结论

6.2本研究的创新之处

6.3后续研究方向

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文