高等植物长链脂肪醇氧化酶初步研究

摘要

一些酵母在以烷烃或长链脂肪酸为碳源进行生长时,首先利用定位在内质网膜上的ω-氧化系统将烷烃或长链脂肪酸氧化形成羧酸或二羧酸,然后进入β-氧化为生物体生长提供碳源及能量。
　　 在ω-氧化中,烷烃或脂肪酸的亚甲基端依次由P450单加氧酶、产生过氧化氢的长链脂肪醇氧化酶(Long-chain fatty alcohol oxidase,FAO)及醛脱氢酶氧化分别生成ω-醇、ω-醛及ω-脂肪酸。
　　 研究表明,当酵母利用烷烃或长链脂肪酸为碳源时,催化第一步反应的P450单加氧酶是由CYP52基因家族的成员编码的。已经发现多种植物中存在与CYP52同源的基因,且这一类基因大都和植物的抗病抗逆相关。既然在植物中存在类似于酵母中催化ω-氧化第一步的酶,那么在植物中是否存在类似的FAO?其功能又是什么?
　　 本研究主要对拟南芥、百脉根及水稻这三种高等植物中的FA0基因进行了基因序列分析、生化功能及生理功能等方面的初步研究。
　　 首先利用酵母FAO的氨基酸序列对拟南芥全基因组序列进行搜索,发现四个与FAO同源性较高的基因,分别是AtFAO1(Atlg03990)、StFAO3(At3g23410)、AtFAO4a(At4g19380)和AtFAO4b(At4g28570)。通过RT-PCR方法获得了AtFAO1(Atlg03990),AtFAO4a(At4g19380)和AtFAO4b(At4g28570)三个基因的全长ORF。
　　 接着利用拟南芥的四个FAO全长氨基酸序列搜索百脉根的EST数据库,得到一个EST序列。根据该序列设计引物并以百脉根顶端cNNA为模板进行3’-RACE,得到一个1.4 kb的片段。以该片段为探针筛选百脉根cDNA文库并最终得到了LjFAO1基因。利用PCR方法得到全长为3.6 kb的LjFAO1基因基因组DNA。另外还通过cDNA文库筛选得到了百脉根中的LjFAO2。
　　 再利用拟南芥中FAO的氨基酸序列对水稻基因组进行tblastn及blastp搜索。结果显示在水稻基因组中存在四个FAO基因,一个位于2号染色体,命名为OsFAO1；另外三个在10号染色体上,分别命名为OsFAO2、OsFAO3和OsFAO4。
　　 对上述的10个FAO基因做序列分析发现:存在于高等植物中的FAO基因大多为三个外显子和两个内含子的基因结构；其氨基酸序列都具有酵母FAO蛋白的五个保守结构域。进化分析表明FAO在单双子叶植物中的分化是在单双子叶植物分化之后。
　　 将得到的基因序列用原核表达系统进行蛋白表达后检测酶活,结果只有AtFAO4b和LjFAO1两个蛋白能够催化长链脂肪醇的氧化。酶动力学分析表明,AtFAO4b和LjFAO1都具有底物特异性。利用Ni-NTA柱纯化这两个蛋白后进行电泳检测,结果都得到了单一的蛋白条带。
　　 对AtFAO3和AtFAO4b的表达模式进行了RT-PCR检测。结果显示:AtFAO3和AtFAO4b基因在整株中均有表达,但是其表达水平在不同组织部位存在差异；AtFAO3和AtFAO4b对低温胁迫响应不同。对AtFAO3和AtFAO4b的T-DNA插入突变体进行病原菌接种,发现病原菌感染对AtFAO3的T-DNA插入突变体生长没有影响,而AtFAO4b的T-DNA插入突变体表现出易感性增高。这些结果说明AtFAO3和AtFAO4b虽然都能够催化长链脂肪醇氧化,但是它们在植物体内的功能不相同。AatFAO4b可能在拟南芥脂肪代谢及细胞壁发育中具有重要的作用。
　　 RT-PCR分析显示LjFAO1在整株中都有表达,但是在顶端表达水平最高而在果荚中表达量最低。在8日龄的百脉根幼苗的顶端和子叶中,LjFAO1表达水平可被低温诱导下调。
　　 对公共数据库中水稻FAO基因的表达模式数据进行分析发现OsFA01和OsFAO4的表达水平较高,OsFAO2和OsFAO3的表达水平较低,而且四个基因对逆境处理有不同的响应。
　　 上述结果说明,在高等植物中普遍存在FAO基因,拟南芥、百脉根与水稻的研究表明该类基因可能与植物的抗病抗逆相关。

目录

文摘

英文文摘

缩写列表

第一章 . 酵母和植物中ω-氧化研究进展

1.1. 酵母中的ω-氧化研究进展

1.1.1. 酵母CYP52的特性与功能

1.1.2. 酵母长链脂肪醇氧化酶研究进展

1.1.3. 酵母脂肪醛脱氢酶研究进展

1.2. 植物中的长链脂肪酸ω-氧化研究进展

1.2.1. 植物中CYP52同源基因的研究进展

1.2.2. 植物中的长链脂肪醇氧化酶基因研究进展

1.3. 本文的目的与意义

第二章 . 材料和方法

2.1. 实验材料

2.1.1. 植物材料

2.1.2. 大肠杆菌菌株

2.1.3. 常用载体

2.1.4. cDNA文库

2.1.5. 常用耗材

2.1.6. 引物序列

2.1.7. 序列分析软件

2.2. 实验方法

2.2.1. 植物材料的培养

2.2.2. 植物基因组DNA的提取

2.2.3. 植物总DNA的制备

2.2.4.PCR反应

2.2.5.PCR产物克隆及鉴定

2.2.6. 基因组Southern blotting

2.2.7. cDNA文库的筛选

2.2.8. 蛋白的制备

2.2.9. 酶活性检测(1ml体系)

2.2.10. 植株的逆境处理

2.2.11. 拟南芥遗传转化及筛选

第三章 . 高等植物长链脂肪醇氧化酶基因的克隆及序列分析

3.1. 前言

3.2. 实验结果

3.2.1. 高等植物长链脂肪醇氧化酶基因的克隆

3.2.2. 高等植物长链脂肪醇氧化酶基因序列分析

3.2.3. Southern Blotting检测百脉根LjFAO拷贝数

3.2.4. 高等植物长链脂肪醇氧化酶的进化分析

3.3. 讨论

3.3.1.LiFAO基因的拷贝数检测及序列分析

3.3.2. 水稻中FAO基因结构的预测

3.3.3. 水稻FAO基因的克隆

3.4. 本章小结

第四章 . 高等植物长链脂肪醇氧化酶的生物化学功能研究

4.1. 前言

4.2. 实验结果

4.2.1. AtFAO4b蛋白的原核表达及纯化

4.2.2. AtFAO4b蛋白的酶活测定

4.2.3. LjFAO1蛋白的原核表达与纯化

4.2.4. LjFAO1蛋白的酶活测定

4.2.5. 截短及点突变LjFAO1蛋白研究

4.3. 讨论

4.3.1. 保守结构域对LjFAO1蛋白酶活性的影响

4.3.2. 底物浓度对酶活性检测的影响

4.3.3. 水稻FAO基因的原核表达

4.4. 本章小结

第五章 . 高等植物长链脂肪醇氧化酶生理功能研究

5.1. 前言

5.2. 实验结果

5.2.1. AtFAO3和AtFAO4b的启动子元件分析

5.2.2. AtFAO3和AtFAO4b的芯片数据分析

5.2.3. AtFAO3和AtFAO4b的表达

5.2.4. AtFAO3和AtFAO4b对冷害处理的响应

5.2.5. AtFAO3和AtFAO4b的T-DNA插入突变体鉴定

5.2.6. AtFAO3和AtFAO4b的T-DNA插入突变体的表型

5.2.7. RT-PCR确定LjFAO1基因的表达模式

5.2.8. LjFAO1对逆境的响应

5.2.9. 水稻FAO基因的表达模式

5.2.10. 水稻FAO基因对逆境的响应

5.2.11. 水稻FAO基因的T-DNA插入突变株系

5.3. 讨论

5.3.1. AtFAO突变体的表型

5.3.2. AtFAO3和AtFAO4b的功能差异

5.3.3. 低温对LjFAO1基因表达水平的影响

5.4. 本章小结

第六章 . 全文总结

6.1. 主要结论

6.2. 研究展望

参考文献

附录一 文中部分基因序列

附录二 载体图谱

在读期间发表论文

致谢