蝎氯毒素BmKCT的碘标记及对脑胶质瘤抑制作用的实验研究

摘要

目的：①蝎氯毒素BmKCT碘标记方法的建立。②131I-BmKCT对脑胶质瘤细胞增殖和细胞周期影响的体外实验。③观察131I-BmKCT在脑胶质瘤裸鼠模型体内不同时间的组织分布，探索131I-BmKCT作为脑胶质瘤放射性核素显像剂的潜力。 方法： 前期基础性研究：合成BmKCT设计引物并构建质粒，通过pGEX系统表达BmKCT，通过GST亲和层析和凝胶过滤可获得纯化的BmKCT。 第一阶段：131I间接标记BmKCT和对胶质瘤细胞的体外抑制作用 通过酰化剂3-(4-羟苯基)丙酸-N琥珀酰胺酯（Bolton-Hunter试剂）将131I标记在羟苯基的2，5位置上，再将琥珀酰胺酯水解，通过一个酰氨键将3-(4-羟基-5-131I-苯基)接在蛋白或多肽的末端氨基上。 MTT法测定肿瘤细胞生长抑制率（GIR），取C6细胞接种96孔板，5.0×103个/孔，设多个平行孔，贴壁后分别加入含不同放射活度131I-BmKCT的培养液，未经标记的BmKCT的培养液，空白组加入等体积不完全培养液（不含血清），MTT法测定吸光度值，计算GIR。根据计算结果绘制细胞生长抑制率曲线。 流式细胞仪分析测定C6细胞DNA含量与周期分布，取对数生长期细胞，制成细胞悬液，接种于培养瓶，细胞贴壁后，实验组加入含不同放射活度131I-BmKCT的培养液，未经标记的BmKCT的培养液，空白组加入等体积不完全培养液（不含血清），培养处理后流式细胞仪进行DNA含量和细胞周期分析。 第二阶段：131I-BmKCT在裸鼠体内的组织分布及SPECT显像 将C6细胞悬液接种于健康裸鼠背部，分别在3h、24h、48h进行SPECT显像。 结果： 前期基础性研究：融合蛋白质经质谱鉴定，分子量与GST融合蛋白理论上一致（31197），ⅹ因子酶切融合蛋白质后，再次质谱分析，分子量（3748）与BmKCT（3749）相一致。 第一阶段：间接标记法获得的131I-BmKCT放射化学纯度达94％，总产率达35％。细胞结合试验显示细胞结合率倒数与细胞倒数线形相关，相关系数R=0.75。 0.2mg/ml浓度的BmKCT对胶质瘤细胞的抑制率为90.5％，与空白组比较，差异具有统计学意义（P<0.01），BmKCT的浓度为2μg/ml时，抑制率为60.5％，当131I-BmKCT放射性浓度为50μCi/ml（浓度小于2μg/ml），抑制率为71.2％，131I-BmKCT抑制细胞增殖和生长的能力优于未标记的BmKCT。BmKCT主要将细胞阻滞在G0/G1期，131I-BmKCT则主要阻滞在S期。 第二阶段：裸鼠体内肿瘤对131I-BmKCT能较好的摄取，且所获SPECT图像清晰。 结论：①建立了131I标记BmKCT的方法。②131I-BmKCT在体外对脑胶质瘤细胞有显著的抑制作用。③131I-BmKCT能较好显示脑胶质瘤裸鼠模型中的肿瘤。体内外实验结果显示131I-BmKCT有作为体内诊断脑胶质瘤显像剂和治疗脑胶质瘤靶向药物的潜力。