磷酸化蛋白在转化生长因子β1致人肾小管上皮细胞损伤中的研究

摘要

肾纤维化是慢性肾脏病(CKD)发展至终末期的最终结果，其病理特征包括肾小球硬化和肾小管间质纤维化。转化生长因子β(TGF-β)是目前公认促纤维化细胞因子之一，阻断TGF-β通路对延缓疾病进展具有重要意义。但因TGF-β有诸多生理功能，故针对TGF-β治疗策略应侧重于其下游细胞因子并探寻新的治疗靶点。蛋白转录后修饰，如磷酸化、泛素化、乙酰化等修饰在调控细胞周期、信号转导等细胞功能中起重要作用，同时蛋白磷酸化修饰在TGF-β信号通路中地位举足轻重。本研究聚焦于TGF-β及相关信号通路中磷酸化蛋白作用机制，为深入探讨TGF-β信号通路提供研究基础。主要内容如下： 第一部分，利用相对和绝对定量的同位素标签试剂(isobaric tags forrelative and absolute quantiration，iTRAQ)对入肾小管上皮细胞(HK-2)总蛋白进行标记，并通过串联质谱分析标记结果。结果提示iTRAQ试剂能成功对HK-2细胞蛋白进行标记，且标记效率及重复性较好，为进一步研究提供了技术平台。 第二部分，利用已成功建立的蛋白质组学技术平台，通过iTRAQ-2D-mano-HPLC-MS/MS技术对TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞损伤过程中磷酸化蛋白进行标记鉴定。通过ProteinPilot软件分析，鉴定出差异表达蛋白38个，其中表达上调磷酸化蛋白19个，表达下调磷酸化蛋白19个；通过生物信息学技术，对表达上调的磷酸化蛋白磷酸化修饰位点、亚细胞定位、功能分类以及蛋白交互调控网络进行分析处理；并对其中两个差异表达磷酸化蛋白(磷酸化HSP900α和磷酸化moesin)通过western blot以验证差异表达。 第三部分，对磷酸化moesin及与moesin具有高度同源性、同属ezrin/radixin/moesin(ERM)蛋白家族的radixin和ezrin蛋白进行研究。结果表明，moesin、ezrin、radixin在亚细胞定位上与细胞骨架高度重叠；TGF-β1可以时间和浓度依赖方式上调磷酸化moesin/ezrin/radixin表达，且上述作用与TGF-β1选择性激活Erk1/2信号通路有关，阻断Erk1/2信号通路可阻断TGF-β1对moesin/ezrin/radixin蛋白磷酸化。 第四部分，对BMP-7和TGF-β1信号通路中磷酸化蛋白表达进行研究。结果表明，BMP-7和TGF-β1可选择性激活不同Smad和MAPK信号通路，即BMP-7可选择性激活p38-MAPK和Smad5使其磷酸化，而TGF-β1可选择性激活Smad2/3和Erk1/2使其发生磷酸化；Smad和MAPK通路在BMP-7信号通路中存在串话。

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论文说明：图表目录、缩略词表

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前言

第一部分 同位素标签技术对人肾小管上皮细胞蛋白标记初步研究

1.引言

2.材料和方法

2.1材料

2.2方法

2.3统计学处理

3.结果

3.1 iTRAQ对人肾小管上皮细胞总蛋白标记结果

3.2 iTRAQ标记质谱初步鉴定结果

3.3 iTRAQ标记效率重复性检验

4.讨论

第二部分 利用同位素标签技术对TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞损伤过程中磷酸化蛋白的蛋白质组学研究

1.引言

2.材料和方法

2.1材料

2.2方法

2.3统计学处理

3.结果

3.1 Real time PCR产物溶解曲线及电泳鉴定

3.2 TGF-β1对HK-2细胞转分化和凋亡影响

3.3 磷酸化蛋白富集结果

3.4 iTRAQ-2D-nano-HPLC-MS／MS结果分析

3.5 表达上调磷酸化蛋白的生物信息学分析

3.6 Western blot验证磷酸化蛋白差异表达

3.7 TGF-β1致肾小管上皮细胞损伤过程中磷酸化蛋白调控网络

4.讨论

第三部分 ERM蛋白在TGF-β1致肾小管上皮细胞损伤中相关研究

1.引言

2.材料和方法

2.1材料

2.2方法

2.3统计学处理

3.结果

3.1 Real-time PCR产物溶解曲线及电泳鉴定

3.2 膜突蛋白、埃兹蛋白和根蛋白在肾小管上皮细胞表达部位鉴定

3.3 TGF-β1对膜突蛋白、埃兹蛋白和根蛋白mRNA和蛋白表达影响

3.4 不同浓度TGF-β1对磷酸化膜突蛋白／埃兹蛋白／根蛋白表达的影响

3.5 TGF-β1对Erk1／2、JNK、p38-MAPK信号通路影响

3.6 阻断Erk1／2信号通路对磷酸化膜突蛋白／埃兹蛋白／根蛋白表达的影响

4.讨论

第四部分 磷酸化蛋白在骨成形蛋白-7拮抗TGF-β1诱导肾小管上皮细胞分泌细胞外基质中的研究

1.引言

2.材料和方法

2.1材料

2.2方法

2.3统计学处理

3.结果

3.1 Real time PCR产物溶解曲线及电泳鉴定

3.3 BMP-7和TGF-β1对Smad信号通路的选择性激活作用

3.4 BMP-7对TGF-β1刺激HK-2细胞Smad蛋白磷酸化和NF-rd3活性影响

3.5 BMP-7和TGF-β1对MAPK信号通路的选择性激活作用

3.6 MAPK与Smad信号通路“串话”在BMP-7信号通路中的作用

4.讨论

结论

参考文献

在读期间发表、撰写文章及会议交流

致谢