不同强度张应力对成骨细胞分化和MAPK磷酸化的影响

摘要

目的： 1.非骨水泥假体的远期稳定性取决于成骨细胞主导的骨—假体界面的骨长入。机械应力的大小影响成骨细胞的功能活性，然而假体周围的应变强度根本不同于成骨细胞所受的应变载荷。由于活体骨组织中单个细胞所受的应变强度目前无法直接测量，因此，为探讨关节置换术后成骨细胞对机械刺激的应答，首先要设法评估骨—假体界面成骨细胞所受机械应变的强度。 2.碱性磷酸酶活性、骨钙素、Cbfa1/Runx2和I型胶原的表达被认为是成骨细胞分化和功能的标志，因而本研究着眼于探讨不同强度的应变对上述基因表达的影响。 3.机械刺激选择性的激活MAPKs信号通路。抛开细胞类型和机械刺激方式的差异不谈，MAPKs信号通路的激活还依赖于许多其他的调节因素。本研究着眼于探讨不同强度的应变对成骨细胞MAPKs磷酸化的影响及其磷酸化水平对机械刺激下成骨细胞合成I型胶原的影响。 4.大多情况下，由应力遮挡引发的骨丢失并不是导致关节置换失败的唯一因素，但其对股骨假体稳定性的负面影响却是不可否认的。本研究在细胞水平探讨股骨假体近端不同强度的应力遮挡对成骨细胞增殖和凋亡的影响。 方法： 1.利用有限元软件ANSTYS5.5，对完整股骨和THR有限元模型进行股骨近端和股骨-假体界面的应力分析。根据有限元分析数据和细胞水平应力扩增理论，间接计算评估细胞水平应变的强度。 2.分别以0.8％、1.6％、2.4％和3.2％的强度在体外对人成骨细胞连续48h施加1 Hz的牵张应力，采用pNPP定量法测定碱性磷酸酶的活性；利用RT-PCR法半定量测定骨钙素、Cbfa1/Runx2和I型胶原的表达。 3.ELISA法测定培养液中前胶原羧基端肽(PICP)的浓度；利用Western-Blot法测定ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平；利用U0126阻断ERK1/2磷酸化，比较I型胶原的mRNA表达和培养液中PICP的浓度的变化。 4.在体外分组模拟应力遮挡的细胞力学环境，A组应变保持不变(对照组)、B-E组应力遮挡分别为25％、50％、75％和100％。利用噻唑蓝法测定成骨细胞相对活性：流式细胞仪测定细胞周期，计算细胞增殖指数和凋亡百分比。 结果： 1.完整股骨近端的应变为815±57με，假体置换后的股骨近端的应变为420±38με。股骨-假体界面的应变由近端向远端逐渐增高，波动于375～1583με之间。根据细胞水平应变扩增模型，上述组织应变传递至细胞水平将扩增20倍。 2.成骨细胞碱性磷酸酶活性的提高出现在0.8％和1.6％的应变水平；2.4％和3.2％的应变促进骨钙素的表达；3.2％的应变增强Cbfa1/Runx2的表达；与静力对照相比，所有应变组I型胶原基因的表达增强；与1.6％应变组相比，I型胶原mRNA水平在0.8％时减弱，在3.2％时增强。PICP的浓度增高仅仅出现在2.4％和3.2％的应变水平(P<0.05)。 3.成骨细胞中ERK的磷酸化水平依赖于所受应变的强度，随所受应变强度的增加而逐渐增高，而p38和JNK的磷酸化水平未受影响。加入U0126后，原有的应变刺激I型胶原表达和PICP合成释放的效应完全被阻断。 4.C、D和E组成骨细胞的相对活性明显降低，分别为0.72±0.09、0.68±0.11和0.76±0.15，与对照组(0.92±0.13)相比差异有显著性(P<0.05)；D组和E组成骨细胞增殖指数降低至47.87±6.58和51.65±7.71，与对照组(64.31±7.92)相比差异有显著性(P<0.05)；C组和D组成骨细胞凋亡的百分比与对照组(7.36±0.59)相比差异有显著性(P<0.05)，分别增高至18.76±2.82和16.78±1.69。B组成骨细胞的相对活性、增殖指数和凋亡百分比与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。 结论： 1.较高强度的应变促进与基质成熟相关的基因的表达，而低强度的应变刺激碱性磷酸酶活性的提高。I型胶原基因表达对张应力的应答呈强度依赖性。 2.ERK1/2的磷酸化对张应力的应答呈强度依赖性。I型胶原的合成依赖于ERK1/2的磷酸化水平。高强度的应变既能促进I型胶原基因的表达，也提高了I型胶原蛋白的合成。 3.股骨假体近端的应力遮挡能抑制成骨细胞增殖并(或)刺激其凋亡，两者皆存在“阈值”现象而缺乏强度依赖性。应力遮挡下凋亡的启动较增殖的抑制更为敏感。

目录

文摘

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论文说明：缩略词表

声明

第一章绪论

1.1股骨-假体结构的力学分析问题

1.2成骨活动的唯一功能细胞-成骨细胞

1.3细胞应力环境的模拟

1.4细胞水平应力应变扩增机制

1.5应力刺激下成骨细胞的分化成熟和MAPK信号通路

1.6本课题研究的目的、内容和意义

参考文献

第二章股骨有限元模型的建立和股骨-假体界面的应力分析

2.1研究背景

2.2材料和方法

2.3结果

2.4讨论

参考文献

第三章不同强度张应力影响成骨细胞分化的体外实验研究

3.1研究背景

3.2材料和方法

3.3结果

3.4讨论

参参考文献

第四章I型胶原的合成依赖于应变的强度和ERK1/2磷酸化水平

4.1研究背景

4.2材料和方法

4.3结果

4.4 讨论

参考文献

第五章股骨假体近端应力遮挡对成骨细胞增殖和凋亡的影响

5.1研究背景

5.2材料和方法

5.3结果

5.4讨论

参考文献

全文结论

综述 机械应力刺激细胞应答的主要敏感指标和MAPK信号通路

致谢

博士在读期间发表论文