碳纳米管与瓣膜基质体外共建人工瓣膜支架及对内皮细胞形态和功能的影响

摘要

目的：⑴研究功能化后纳米管及与瓣膜基质结合生物力学及形态学改变。⑵从大鼠骨髓中得到单个核细胞，通过分离、纯化及体外培养的方法获取EPCs，并进行鉴定。⑶研究功能化碳纳米管与内皮细胞培养时对其形态和功能的影响。⑷观察人工瓣膜支架对内皮细胞粘附的影响。 方法：①对比胰蛋白酶法、十二烷基硫酸钠法和程序化脱细胞法去除细胞后心脏瓣膜形态学及生物力学差别。研究脱细胞后基质免疫反应。②取大鼠股骨骨髓细胞，EBM-2培养基培养；流式细胞仪鉴定：CD34，CD44及免疫组化eNOS、VIII因子、vWF和PCR测eNOS、VEGF和vWF表达，吞噬LDL试验。③将不同浓度功能化碳纳米管与同期同批次内皮细胞共同培养，观察内皮细胞形态学改变。PCR及RT-PCR测eNOS、VEGF和vWF表达比较碳纳米管对内皮细胞影响。④将碳纳米管与瓣膜基质共建的人工瓣膜支架与内皮细胞共同培养，观察内皮细胞粘附情况。 结果：⑴胰蛋白酶法脱细胞效果差，对基质破坏明显；十二烷基硫酸钠法可完全脱细胞，对基质破坏较大；程序化脱细胞法完全脱细胞同时对基质破坏较少；三种方法处理后生物力学有统计学意义。⑵EPCs为梭形或多角形。成群细胞呈现“鹅卵石”样排列。CD34(+)，CD44(-)；可见eNOS、VIII因子和VEGF、vWF表达及吞噬LDL现象。Passage3、4生长较好，Passage5后开始分化。⑶加功能化碳纳米管后一天内皮细胞不易贴壁，形态变圆或不规则，第二天起内皮细胞开始贴壁及恢复正常形态，并与碳纳米管紧密结合；低浓度时对数生长期较无功能化碳纳米管推迟2～3天，PCR示影响eNOS、VEGF和vWF量的表达，但real-time PCR统计表明仅对VEGF有统计学意义。⑷内皮细胞较易粘附于瓣膜支架，SEM观察呈橄榄球形并见触角位于碳纳米管与瓣膜基质之间，单体或成群细胞出现，可见向基质深处延伸生长趋势。 结论：①程序化脱细胞法更合理的去除细胞并最大程度保存细胞外基质，与功能化纳米管体外结合可改善生物力学性状。②骨髓中分离培养EPCs相对较容易；EPCs对培养液的要求较高，必须用特殊配方培养液。需要VEGF、碱性纤维生长因子(bFGF)等多种刺激因子存在。体外培养易受多种因素影响而分化。③功能化碳纳米管可与内皮细胞紧密结合，早期减少细胞活性。低浓度对eNOS和vWF量的表达影响无统计学意义。④功能化碳纳米管促进内皮细胞与瓣膜基质结合并可对内皮细胞向基质深处生长起“吸附”作用。

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前言

第一章不同方法处理瓣膜及与功能化碳纳米管体外共建瓣膜支架

1.1实验材料

1.2实验方法

1.3实验结果

1.4讨论

1.5小结

1.6参考文献

第二章 大鼠骨髓内皮祖细胞分离、培养和鉴定

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4讨论

2.5小结

2.6参考文献

第三章 功能化碳纳米管对内皮细胞形态和功能的影响实验材料

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3实验结果

3.4讨论

3.5小结

3.6参考文献

第四章 瓣膜支架与内皮细胞体外共建人工瓣膜

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3实验结果

4.4 讨论

4.5 小结

4.6参考文献

文献综述 组织工程心脏瓣膜的研究进展

致谢

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