选择性杀伤癌胚抗原阳性肿瘤细胞的条件复制型腺病毒载体的构建和应用

摘要

目的：为了探索治疗结直肠癌的新方法，我们构建了携带自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidine kinase，HSVtk），并能选择性杀伤癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）阳性肿瘤细胞的条件复制型腺病毒载体，观察其在CEA 阳性及阴性肿瘤细胞内复制能力的差异，并进一步研究联合使用该载体与前药更昔洛韦（ganciclovir，GCV）后，对体外培养的肿瘤细胞的杀伤作用。 方法：以结肠癌细胞Lovo基因组DNA为模板，PCR 扩增CEA基因5’端调控序列，将其定向克隆入携带增强型绿色荧光蛋白（EnhancedGreen Fluorescent Protein，EGFP）及萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，Luc）融合报告基因（EGFP-Luc）的载体PCMV-EGFPLuc-N1中，构建表达质粒pCEA-EGFPLuc。利用脂质体将pCEA-EGFPLuc 导入CEA 阳性及阴性细胞中，通过荧光显微镜、流式细胞仪及荧光分光光度计检测EGFP阳性率、平均荧光强度和Luciferase 活性，评价所分离到的CEA基因启动子的活性和选择性。然后构建由CEA 启动子调控腺病毒复制必需早期基因E1A 表达并携带HSVtk基因的穿梭质粒，与腺病毒骨架质粒共转染Ad293细胞，包装重组腺病毒Ad.CEA-E1A/CMV-TK。采用Ad.CEA-E1A/CMV-TK 分别感染CEA 阳性和阴性肿瘤细胞后，通过检测E1A 表达及病毒增殖，评价该病毒能否在CEA 阳性肿瘤细胞中选择性复制；显微镜观察被感染细胞的病变情况、CCK-8 检测被感染细胞的生存率，评价该病毒是否能够选择性杀伤CEA 阳性肿瘤细胞；最后联合使用该病毒及前药GCV，观察前药GCV 与该腺病毒载体间是否具有协同作用。 结果：pCEA-EGFPLuc转染CEA阳性的Lovo和阴性的Ad293细胞后，EGFP的阳性率分别为15.6％和0.53％；在Lovo细胞中，Luciferase酶的活性是Ad293细胞的4 x 102倍，表明分离到的CEA启动子具有较好的选择性。与目前广泛应用的、组成性表达的、强病毒启动子CMV调控的pCMV-EGFPLuc-N1转染结果比较，CEA启动子调控的pCEA-EGFPLuc其EGFP的阳性率是CMV的0.6 倍，而luciferase的活性是CMV的0.36 倍，表明CEA启动子的活性也是相对较高的。采用空斑形成实验（plaqueforming unit，PFU）比较野生型腺病毒dl309 与Ad.CEA-E1A/CMV-TK在CEA阳性及阴性细胞内的复制效率差异，在CEA阳性的肿瘤细胞中dl309与Ad.CEA-E1A/CMV-TK的病毒滴度差异在同一个对数数量级之内，但在CEA阴性的细胞中，病毒滴度差异达到3个对数数量级，表明Ad.CEA-E1A/CMV-TK能选择性的在CEA阳性的肿瘤细胞中复制。以20MOI的Ad.CEA-E1A/CMV-TK分别感染CEA阳性肿瘤细胞Lovo、SW620和CEA阴性肿瘤细胞Hela，5天后细胞生存率分别为36.72±2.49％、39.82±4.76％和87.44±2.76％。表明Ad.CEA-E1A/CMV-TK能选择性杀伤CEA阳性的肿瘤细胞。当Ad.CEA-E1A/CMV-TK与GCV联合使用时，其对Lovo和SW620的杀伤效果进一步增加，细胞生存率下降至17.26±3.65％和23.93±5.40％。 结论：由CEA 调控复制的Ad.CEA-E1A/CMV-TK 对CEA 阳性肿瘤细胞具有选择性杀伤作用，当联合GCV 后杀伤效果明显增强。