IRE1α-XBP-1介导的内质网应激与胰岛β细胞糖毒性的研究

摘要

目的:糖毒性是引起2型糖尿病患者胰岛细胞功能衰竭的重要原因，其机制目前尚不明了。在胰岛β细胞内，内质网是胰岛素生物合成及新合成胰岛素原折叠加工的重要场所。有研究提示短暂暴露于高糖常伴随IRE1α的磷酸化，活化的IRE1α信号通路对胰岛β细胞有保护作用。而对于糖尿病而言，胰岛β细胞并非短暂而是长期处于高糖环境下，所以本研究拟通过小鼠胰岛细胞株和大鼠原代胰岛体外观察IRE1α信号通路介导的内质网应激与持续暴露于高糖的胰岛β细胞功能之间的关系。在此基础上，建立高脂喂养的肥胖动物模型，观察肥胖大鼠胰岛在持续性高糖条件下是否更容易产内质网应激，探索内质网应激在其中的作用和可能机制。 材料与方法: 1）将不同浓度葡萄糖（5.6、25和33.3 mmol/L组）分别加入胰岛β细胞株MIN6培养液中，于不同时间点（24 h和96 h）收集细胞进行相关检测。CCK-8法检测细胞增殖活力；ELISA法检测胰岛素和胰岛素原分泌能力；Real-time PCR和Western blotting分别检测内质网应激相关分子Total XBP-1、Spliced XBP-1 mRNA及磷酸化IRE1α蛋白表达。 2）原位灌注法分离胰岛，将不同浓度葡萄糖（5.6、25 mmol/L组）分别加入大鼠原代胰岛培养液中，培养不同时间（24 h和96 h）后收集胰岛进行相关检测。 3）建立高脂诱导肥胖大鼠模型，原位灌注分离胰岛，置于含25mmol/L葡萄糖的培液中孵育24h和96h，利用Real time PCR和免疫印记技术检验肥胖大鼠胰岛内质网相关分子mRNA及蛋白表达。 结果: 1）加入葡萄糖后96 h，各组细胞增殖活力均显著低于孵育后24 h；在同一时间点，33.3和25 mmol/L组显著低于5.6 mmol/L组。加入葡萄糖后96 h，33.3 mmol/L组胰岛素分泌较干预后24 h明显减少，而胰岛素原分泌显著增加。加入葡萄糖后24 h和96 h的各组Spliced XBP-1 mRNA表达，以及加入葡萄糖后96 h的各组Total XBP-1 mRNA和磷酸化XBP- IRE1α蛋白表达，均随葡萄糖浓度的增加而上调，呈现浓度依赖性。 2) 25mmol/L葡萄糖组经96h孵育后，葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力较24h组明显下降，胰岛素原的分泌较24h有显著增加。25mmol/L葡萄糖组孵育96小时后，BIP、Sliped-XBP-1 mRNA 表达较24小时显著减少，CHOP mRNA表达则较24小时明显增加，且较5.6mmol/L组亦显著增加。孵育24小时，5.6、25mmol/L葡萄糖组均可磷酸化IRE1α，但96小时后5.6mmolL组的磷酸化IRE1α减弱，25mmol/L组的磷酸化IRE1α则完全消失。 3）孵育96小时后HF组胰岛中CHOP mRNA表达较CON组明显升高，Spliced XBP-1、Total XBP-1无明显差异。两组胰岛孵育24小时后均可见磷酸化的IRE1α，96小时则明显减弱。 结论:持续性高糖可使胰岛β细胞的增殖活力下降、分泌功能受损及内质网应激相关分子表达增加，而后者可能是导致葡萄糖毒性的原因之一。原代胰岛较MIN6细胞株对持续性高糖的耐受性差，长时间的高糖使非折叠蛋白反应（UPR）对其保护作用减弱，并导致损伤。肥胖组胰岛对糖毒性更敏感，容易出现损伤。本实验初步探讨了IRE1α-XBP-1介导的内质网应激对持续性高糖损伤胰岛β细胞功能的作用，为进一步研究内质网应激与胰岛β细胞糖毒性的关系 奠定了基础。