基质金属蛋白酶-9在糖尿病性视网膜血视网膜屏障功能损害中的作用及其机制研究

摘要

细胞试验部分：糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞MMP9表达的影响及机制研究 目的：研究糖基化终产物(AGEs)处理后的人脐静脉内皮细胞MMP9表达及其上游信号通路，观察内皮细胞间紧密连接蛋白occludin蛋白表达的情况。方法：取培养后传代3-4代的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，分组如下(8组)：空白组，BSA组，AGEs组，米诺环素+AGEs组，GM6001+AGEs组，AG490+AGEs组，VEGF抗体+AGEs组，抗氧化剂+AGEs组。孵育48h后，收集各组细胞，RT-PCR方法检测各组MMP9基因表达；对AGEs组，BSA组，米诺环素+AGEs组，以及GM6001+AGEs等4组，采用Western Blot方法检测其MMP9，以及occludin蛋白表达情况，并且用细胞免疫荧光法观察occludin在内皮细胞的表达。结果：各组人脐静脉内皮细胞均有MMP9的基因表达，经过AGEs处理后的内皮细胞其MMP9表达明显升高(P<0.01)，而在AGEs处理同时给予抗氧化剂，VEGF抗体，GM6001，以及米诺环素处理后，其MMP9的表达下降，与AGEs处理组有统计学差异(p<0.05)。经AGEs处理后内皮细胞MMP9蛋白表达亦升高(p<0.05)，同时，occludin蛋白表达下调(p<0.05)，而经过GM6001以及米诺环素处理后，内皮细胞的MMP9蛋白表达异常升高受到抑制，同时occludin蛋白表达异常下调得到改善，内皮细胞间的连接形态改善。结论：AGEs能通过上调MMP9的表达破坏内皮细胞紧密连接蛋白occludin，这个过程与氧化应激，VEGF等因素有密切关系，这可能是糖尿病性视网膜病变血视网膜屏障破坏的重要原因：MMP9的抑制剂GM6001以及米诺环素能抑制这个病理过程，改善内皮细胞的连接状态。 动物试验部分：I：基质金属蛋白酶9在糖基化终产物所致的大鼠视网膜微血管渗漏中作用研究 目的：在体研究基质金属蛋白酶-9(MMP9)在糖基化终产物所致的血-视网膜屏障损害中的作用，评估米诺环素对AGEs所致的血-视网膜屏障损害的治疗作用。方法：48只SD大鼠随机分成3组：对照组(n=16)，AGEs-BSA组(n=16)和AGEs-BSA+米诺环素组(n=16)。对照组和AGEs-BSA组分别自尾静脉注入对照物BSA和AGEs-BSA，每天一次，每次40mg/kg，AGEs-BSA+米诺环素组在每天注入AGEs-BSA的同时隔日腹腔注射米诺环素45mg/kg。14天后，每组取6只大鼠用伊文斯兰法观察并比较各组视网膜血管通透性，其余大鼠处死后，采用RT-PCR、WESTERN BLOT法观察视网膜MMP9的表达。结果：AGEs-BAS组MMP9mRNA和蛋白水平均较对照组显著升高(P<0.01)，同时，网膜微血管渗透性也显著升高(P<0.01)。而在AGEs-BSA处理同时给予米诺环素的大鼠视网膜基因和蛋白水平的MMP9均被抑制(P<0.01)，同时网膜微血管渗漏被部分逆转(P<0.01)。视网膜微血管渗透性与MMP9蛋白表达间存在正相关(R=0.8916，P<0.01)。结论：AGEs所致的视网膜微血管渗漏与MMP9的高表达有密切关系，AGEs的作用至少部分是通过MMP9实现。米诺环素能部分逆转AGEs-MMP9途径所致的血管渗漏。 动物试验II：米诺环素对糖尿病性大鼠视网膜电图异常和血管渗漏治疗作用的初步观察 目的：观察米诺环素对糖尿病性视网膜病变大鼠视网膜电图和血管渗透性的影响。方法：40只SD大鼠，用STZ法建立糖尿病性视网膜病变模型，建模成功后34只，其中24只以米诺环素灌胃，按给药浓度不同建立试验组1和实验组2，剩余10只作为糖尿病视网膜病变组(DM组)，健康相当体重SD大鼠10只作为正常对照(CON组)。实验组1(T1组)和试验组2(T2组)分别给予2.5mg/kg，5mg/kg浓度的米诺环素，每日一次灌胃，连续两个月后，用视觉电生理仪测定各组大鼠ERG b波和OPs，并且用伊文思兰法测定大鼠视网膜血管渗透性。HE切片观察各组视网膜形态。四组间进行比较分析。结果：糖尿病视网膜大鼠其视网膜电图b波以及OPs均值显著低于正常大鼠，血管渗透性异常升高，而经过米诺环素治疗的大鼠其视网膜电图指标和血管渗透性异常同时得到改善。结论：米诺环素能剂量依赖性地改善糖尿病性大鼠视网膜ERGb波、OPs波振幅，以及微血管渗漏，米诺环素是一种潜在的治疗糖尿病性视网膜病变的有效药物。

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论文说明：缩略词表

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绪 论

1.细胞试验部分：糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞MMP9表达的影响及机制研究

1.1引言

1.2材料和方法

1.3结果

1.4讨论

1.5本章小结

1.6参考文献

动物试验部分Ⅰ2.基质金属蛋白酶9在糖基化终产物所致的大鼠视网膜微血管渗漏中作用研究

2.1引言

2.2材料和方法

2.3结果

2.4讨论

2.5小结

2.6参考文献

动物试验Ⅱ3.米诺环素对糖尿病性视网膜病变大鼠治疗的初步观察

3.1引言

3.2材料和方法

3.3结果

3.4讨论

3.5小结

3.6参考文献

全文总结

附录一：主要试剂配制

附录二综述 糖尿病血视网膜屏障破坏的机制研究进展

附录三、在读期间发表的论文和主要成果

致谢