家族性局灶节段性肾小球硬化症临床及致病基因研究

摘要

局灶节段性肾小球硬化症(Focal segmental glomerularsclerosis，FSGS)是最常见的原发性肾小球肾炎之一。其特征为累及肾小球中部分毛细血管襻小叶的非炎症性硬化和肾小球上皮细胞足突融合、消失。临床表现为中到大量蛋白尿、浮肿、高血压、肾功能不全。相当一部分FSGS患者对激素等药物不敏感，肾功能进行性恶化至终末期肾功能衰竭。因此对其发病机制及治疗的研究成为热点。FSGS根据病因可分为原发性、继发性及家族性/遗传性三类。其中家族性FSGS是指一个家族中有多人患病的情况，相对少见，且患者临床表现缺乏特异性，因而对其认识不足，容易漏诊。近年来通过对家族性FSGS的连锁分析及定位克隆研究发现了NPHS1、NPHS2、ACTN4、TRPC6、PLCE1、INF2等数个致病基因，它们的编码产物均表达在肾小球足细胞上，表明足细胞损伤在家族性FSGS发病中起到关键作用。对上述足细胞分子的研究还发现它们在原发性FSGS发病中也有重要作用，为全面理解FSGS致病机理提供了重要帮助。但目前已发现的致病基因仅能解释少数家族性FSGS的病因，相当一部分家系致病基因尚不明确。因此对家族性FSGS的临床特点总结及对致病基因筛查与功能研究，可提高对该疾病的临床及发病机理的认识。而对合适的家系进行连锁分析及定位克隆，将有希望发现新的致病基因。目前国际上有关于家族性FSGS的家系报道及单个基因筛查与功能研究的报道，但国内外尚无对多个FSGS家系从临床到致病基因筛查、功能研究再到新致病基因定位的系列研究。
　　 本研究第一部分对瑞金医院自1997年9月到2009年6月收集的共47个FSGS家系及其106名患者进行临床特点总结，并选取同期150例散发性FSGS患者作为对照。发现家族性FSGS患者的临床表现与散发性FSGS患者相似，但激素及免疫抑制剂疗效差。对其中的16个家系先证者筛查TRPC6、ACTN4和NPHS2的基因突变，100例正常人作为对照。发现TRPC6基因SNP7个，ACTN4基因SNP10个，NPHS2基因SNP7个。并根据家族性FSGS患者的临床特点及基因检测结果建立完善了对该病的临床诊治及基因筛查体系。
　　 本研究第二部分对先前发现的ACTN4 L316P突变进行深入功能研究。采用定点诱变构建成功含有L316P突变和K255E突变(阳性对照)的ACTN4-fl-GFP-N1质粒，将野生型及突变型质粒转染体外培养的人足细胞，应用免疫荧光法及共聚焦显微镜观察α-actinin-4在细胞内的定位及足细胞骨架蛋白F-actin的表达情况。发现转染ACTN4 K255E和L316P突变质粒后，α-actinin-4在足细胞内的定位明显改变：野生型α-actinin-4均匀表达于足细胞胞浆中，K255E突变型α-actinin-4聚集在细胞核周围，而L316P突变型α-actinin-4则主要分布在胞浆内近胞膜处。转染了L316P突变的足细胞内细胞骨架蛋白F-actin表达减弱，正常的丝状结构遭破坏。
　　 本研究第三部分对一个累及四代的FSGS家系进行了新致病基因的探索。家系调查后对78名成员进行仔细临床检查，明确家系临床特征及遗传方式。在先证者中对可能的已知致病基因NPHS2、ACTN4和TRPC6进行PCR扩增、测序排除致病突变。再以单核苷酸多态性(SNP)芯片为标记对该家系关键成员进行全基因组扫描，采用Merlin和SimWalk2软件，分别以参数法和非参数法连锁分析对该家系的致病基因进行了定位研究。结果发现该家系符合常染色体显性遗传规律，迟发起病，患者11名。先证者NPHS2，ACTN4和TRPC6基因筛查未发现致病突变。芯片数据分析计算后发现在rs1431213处获得最大优势对数(LOD)值3.795，进一步单倍型分析将该家系的致病基因定位于6号染色体长臂1区6带至2区2带之间(6q16～22)约5Mb的范围内，为一新的致病基因连锁区域。
　　 综上所述，家族性FSGS患者的临床表现与散发性患者相似，但其治疗效果差。对16个家系先证者的筛查中，发现了NPHS2、TRPC6和NPHS2基因的数个SNP。根据患者的临床表现和基因检测结果建立完善了家族性FSGS患者的临床诊治和基因筛查体系。功能缺失性ACTN4L316P突变可导致α-actinin-4在足细胞内定位改变，并导致足细胞骨架蛋白F-actin表达减弱，细胞骨架结构破坏。对一个累及四代的中国汉族人FSGS大家系的连锁分析将其致病基因初步定位在一个新的区域6q16～22约5Mb范围内，有助于进一步明确该家系的致病基因。