变铅青链霉菌DNA磷硫酰化优先修饰区的功能研究

摘要

DNA的磷硫酰化修饰广泛存在于细菌中。在变铅青链霉菌中的质粒pIJ101上发现了一个优先修饰位点，其位于一段130bp的区域内，含有一个4bp的核心序列，由三个正向重复和两对反向重复环绕。通过荧光凝胶阻滞电泳实验，发现野生型变铅青链霉菌1326的总蛋白与优先修饰序列产生三条迁移条带，其特异性经随机探针的竞争实验得到验证。Dnd突变株的实验表明这三个迁移条带并非由Dnd蛋白产生的。经过硫酸链霉素沉淀，硫酸铵分级，疏水柱层析，阴离子交换层析和非变性梯度凝胶电泳等纯化步骤，结合串联质谱鉴定到迁移条带中的两个蛋白质，分别是天蓝色链霉菌DNA旋转酶A亚基(GyraseA，SCO3873)和多核苷酸磷酸化酶(PNPase，SCO5737)的同源蛋白。为了验证这一结果，从变铅青链霉菌的基因组中扩增了pnpase和gyraseA基因，并克隆到表达载体pET15b上。表达并纯化了带有His标签的PNPase和GyraseA的融合蛋白。异源表达的PNPase在凝胶阻滞电泳中显示出与野生型的PNPase相似的迁移条带和结合特异性；而表达的GyraseA则与优先修饰序列结合微弱。用表达的PNPase制备了兔多抗。用超迁移实验证明了变铅青链霉菌总蛋白产生的三条迁移条带中的第二条对应于PNPase。
　　 PNPase已知的功能与RNA代谢有关，如mRNA的降解和RNA 3'尾部的合成等。我们发现PNPase与DNA磷硫酰化的优先修饰序列特异地结合，其功能需要进一步的研究。由于有报道pnpase是必需基因，我们采用过表达和反义RNA沉默的方法来改变体内PNPase的水平，以期观察到对细菌生理或硫修饰的影响。这将有助于我们了解DNA磷硫酰化过程中优先选择修饰的生理意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明

声明

第一章 文献综述

第二章 材料与方法

第三章 优先修饰区结合蛋白的检测与特性研究

第四章 优先修饰区结合蛋白的纯化与鉴定

第五章 Gyrase A和PNPase的异源表达与免疫检测

第六章 全文总结

参 考 文 献

致 谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文