门静脉间质细胞自发性内向电流特性及牵张刺激对其调控作用

摘要

Cajal间质细胞(Interstitial Cells of Cajal,ICCs)是一百多年前由西班牙神经解剖学家Cajal在胃肠道发现的一种具有起搏功能的细胞。与平滑肌细胞相比较,这种细胞主要具有两个特点:(1)它表达一种酪氨酸激酶受体-c-Kit蛋白,因此c-Kit染色呈阳性；(2)它可以产生自发性节律性的内向电流,即起搏电流。关于起搏电流产生的机制目前还存在争议,主要观点认为它可能是由于低钙敏感的非选择性阳离子通道开放或钙激活氯通道开放产生。近年来人们在门静脉血管壁上发现了与ICCs形态类似的细胞并将其定义为间质细胞(Interstitial Cells,ICs)。研究显示,门静脉不同部位收缩频率的快慢与间质细胞在门静脉分布密度的高低呈现相关性,并且,间质细胞内产生的自发性节律性钙振荡(Ca2+oscillations)可以诱发自身以及与其邻近的平滑肌细胞膜电位产生去极化反应。以上结果表明,间质细胞可能是门静脉发生自发性节律性收缩运动的起搏细胞。从电生理学角度讲,判断一种细胞是否是起搏细胞的最重要的证据是能否记录到起搏电流,但是迄今为止,国内外研究中尚没有直接在门静脉间质细胞上记录到该电流的报道。因此,本文使用酶解分离的方法得到单个间质细胞,并在此基础上,进一步应用免疫化学与全细胞膜片钳技术研究家兔门静脉间质细胞的形态及电生理学特性,以探讨门静脉自发节律性收缩的起搏机制。
　　 结果：显示:(1)门静脉在体外可以产生自发性收缩活动,其平均频率约为6.3±1.0次/min(n=7)；(2)使用ⅠA型胶原酶及Ⅹ型蛋白酶分离家兔门静脉得到两种不同类型细胞:典型的胞膜光滑的平滑肌细胞及胞膜带有突起的间质细胞(ICs)。而间质细胞又根据形态的不同分为两种:星形及纺锤状细胞。分离得到的ICs c-Kit染色呈阳性,而平滑肌细胞染色呈阴性；(3)应用全细胞模式的膜片钳技术,将钳制电压固定在-60mV,在间质细胞上记录到两种不同类型的自发性内向电流:频率慢持续时间长的电流(平均频率12±0.66次/min,n=45)及频率快持续时间短的电流,即自发性瞬间内向电流(spontaneous transient inwardcurrents,STIC,平均频率29.35±1.33次/min,n=40)。但是在相同实验条件下,在平滑肌细胞上没有记录到类似的自发性电活动；(4)非选择性阳离子通道阻断剂gadolinium及氯通道阻断剂niflumic acid均可完全阻断上述两种不同频率的自发性内向电流；用NMDG+取代胞外灌流液中的Na+也可完全阻断两种频率的自发性内向电流；(5)ICs产生的两种不同频率的自发性内向电流均可被caffeine及FCCP完全抑制,但是使用含有10mmol/LEGTA的电极内液,没有记录到任何形式的自发性内向电流；胞外无钙液能明显增加两种频率自发性内向电流的振幅并降低其频率,也明显降低自发性瞬间外向电流(spontaneous transient inward currents,STOCs)的振幅及频率；(6)胞内钙库钙泵抑制剂thapsigargin可以完全抑制两种不同频率的自发性内向电流；IP3受体介导的钙库抑制剂2-APB对两种频率的自发性内向电流的振幅及频率均有部分抑制作用,而ryanodine受体介导的钙库抑制剂ryanodine则可完全阻断两种频率的自发性内向电流；(7)钙调蛋白抑制剂W-7明显增加慢频率自发性内向电流的振幅和频率,而只增加STICs的振幅；(8)细胞外低渗诱发的牵张刺激可以增加慢频率自发性内向电流的振幅并减慢其频率,并且明显增加平滑肌细胞L型钙电流的振幅。
　　 以上结果提示:(1)在家兔门静脉间质细胞上记录到的两种不同频率的自发性内向电流,均主要由非选择性阳离子通道开放产生；但是,在本研究实验条件下,也不排除氯通道参与内向电流产生的可能性；(2)胞内钙活动及钙调蛋白对这两种电流的产生均起调节作用,并且IP3受体及ryanodine受体介导的钙库均参与两种内向电流的产生,而其中ryanodine受体介导的钙库可能起主要作用；(3)牵张刺激对门静脉收缩活动的影响可能主要表现在增强平滑肌的收缩幅度,而使其收缩频率减慢。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语

第一章 家兔门静脉间质细胞自发性节律性内向电流特性

1.1 引言

1.2 材料和方法

1.2.1 实验仪器

1.2.2 药品及溶液配置

1.2.3 实验方法

1.3 实验结果

1.3.1 家兔门静脉的自发性收缩运动

1.3.2 门静脉间质细胞的形态学观察及免疫学鉴定

1.3.3 门静脉间质细胞上记录到的自发性内向电流

1.3.4 gadolinium,niflumicacid及NMDG对自发性内向电流的影响

1.3.5 胞内钙浓度变化对自发性内向电流的影响

1.3.6 钙调蛋內抑制剂对自发性内向电流的影响

1.4 讨论

1.5 本章小结

参考文献

第二章 牵张刺激对家兔门静脉间质细胞自发性内向电流的调控作用

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.2.1 实验仪器

2.2.2 溶液配置

2.2.3 实验方法

2.3 实验结果

2.3.1 低渗诱发的牵张刺激对ICs慢频率自发性内向电流的作用

2.3.2 低渗诱发的牵张刺激对平滑肌细胞L型钙电流的作用

2.4 讨论

2.5 本章小结

参考文献

第三章 全文总结

3.1 主要结论

3.2 研究展望

第四章 文献综述:消化道外间质细胞研究进展

4.1 概述

4.2 ICS的形态、分布及鉴定

4.2.1 c-Kit染色鉴定

4.2.2 超微结构鉴定

4.2.3 其它鉴定方法

4.2.4 ICs的形态及分布

4.3 ICs的生理特性

4.3.1 一般特性

4.3.2 胞内自发性钙振荡

4.4 ICS的功能

4.4.1 起搏功能

4.4.2 神经信号传递功能

4.5 ICS与疾病

4.6 前景展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间已发表或录用的论文