超声联合SonoVue辐照介导FD500转入人前列腺癌两种细胞株的辐照方法和条件的实验研究

摘要

前列腺癌的基因治疗是前列腺癌治疗的研究热点，有着广阔的应用前景。基因治疗需要安全有效的基因转染方法，目前常用的基因转染方法有病毒性转染和脂质体转染，这两种转染方法分别存在细胞毒性和转染效率低下的不足。超声介导的基因转染无细胞毒性，已经成为常用的基因转染方法。这种转染方法需要探索适宜的辐照方法和辐照条件来提高基因转染率。本研究拟采用超声联合微泡造影剂SonoVue辐照介导FD500转入人前列腺癌两种细胞，通过比较二次超声辐照法和单次超声辐照法对细胞通透性和存活率的影响来探讨适宜的辐照方法，而后采用适宜的方法来探讨不同的辐照条件对两种细胞的通透性和存活率的影响，以找出两种细胞的最适宜辐照条件，为前列腺癌基因治疗提供参考。
　　 第Ⅰ部分超声辐照方法以及辐照参数对人前列腺癌两种细胞的通透性和存活率的影响
　　 第一章二次超声辐照和一次超声辐照对人前列腺癌两种细胞的通透性和存活率的影响
　　 目的：比较二次超声辐照法和单次超声辐照法对人前列腺癌两种细胞的通透性和存活率的影响。
　　 方法：设置时间为20s、造影剂浓度为20％、声强分别为0.6w∕cm2和0.9w∕cm2的辐照条件，采用二次超声辐照法和单次超声辐照法分别辐照人前列腺癌两种细胞。以流式细胞仪测细胞发光率，以台盼蓝拒染法测细胞存活率，比较两种辐照方法的细胞发光率和存活率。
　　 结果：以声强0.6w∕cm2、时间20s辐照时，二次辐照组的细胞发光率和存活率均低于单次辐照组(P<0.05)，以声强0.9w∕cm2、时间20s辐照时，二次辐照组的细胞发光率和存活率均明显低于单次辐照组(P<0.01)。
　　 结论：与二次超声辐照法相比，单次超声辐照法的细胞发光率和存活率均较高，因此宜采用单次超声辐照法进行后续超声辐照的实验研究。
　　 第二章辐照声强、时间和造影剂浓度对人前列腺癌两种细胞的通透和存活率的影响
　　 目的：探讨人前列腺癌两种细胞株的通透性和存活率在声强、时间和造影剂浓度三种参数下的变化趋势并确定这三种参数对于前列腺癌细胞的适宜范围。
　　 方法：以不同的声强、时间和造影剂浓度辐照PC3细胞和LNcap细胞。分别设0.6w∕cm2、0.9w∕cm2、1.2∕cm2、1.5w∕cm2四种声强， 10s、20s、40s、60s四种时间， 10％、 20％、30％、40％四种造影剂浓度辐照两种前列腺癌细胞。以流式细胞仪测细胞发光率，以台盼蓝拒染法测细胞存活率。探讨细胞发光率和存活率在不同辐照参数下的变化趋势，并以存活率大于75％为标准来确定适宜的参数范围。
　　 结果：PC3细胞的发光率随着辐照声强的增加而增加（P<0.01），而LNcap细胞的发光率随着声强的增加先有增加后又下降（P<0.01）。两种细胞的存活率都随辐照时间的增加而降低（P<0.01），适宜的声强范围为0.6 w∕cm2到1.2 w∕cm2。PC3细胞和LNcap细胞的发光率均随辐照时间的增加而逐渐增加（P<0.01），两种细胞的存活率均随辐照时间的延长而降低（P<0.01），适宜时间范围为10s到40s。当造影剂浓度由10％增加30％时，PC3细胞和LNcap细胞的发光率不断增加（P<0.05），当造影剂浓度增加到40％时，两种细胞的发光率不再上升（P>0.05）。两种细胞的存活率均随造影剂浓度的增加而下降（P<0.05），适宜的造影剂范围为10％到30％。
　　 结论：两种细胞适宜的辐照声强范围为0.6 w∕cm2到1.2 w∕cm2，适宜的辐照时间范围为10s到40s，适宜的造影剂浓度范围为10％到30％。在适宜的参数范围内，随辐照声强、时间和造影剂浓度的增加，细胞的发光率增加而存活率下降。
　　 第Ⅱ部分人前列癌两种细胞的辐照参数优化研究
　　 第三章随机组合法和参数固定法对前列腺癌细胞辐照参数选择的比较研究
　　 目的：探讨采用随机组合法和参数固定法在筛选前列腺细胞适宜辐照条件中的差异性。
　　 方法：分别以随机组合法和固定参数法设置不同的参数组合辐照PC3细胞。随机组合法是将声强、时间和造影剂浓度随机组合成27种参数组合。参数固定法是以固定两种参数变化一种参数的方式设9种参数组合。以流式细胞仪测细胞发光率，以台盼蓝拒染法测细胞存活率。通过比较两种方法取得的最适宜辐照条件来探讨两种方法中的参数设置对细胞的最适宜辐照条件有无影响。
　　 结果：随机组合法的27种不同辐照参数组合对前列腺癌细胞辐照结果，除当辐照声强为1.2∕cm2，且造影剂浓度为20％或30％时，细胞发光率随辐照时间的增加呈先增后降的趋势外（P<0.01），其余辐照条件的细胞发光率随辐照声强、时间和造影剂浓度的增加而增加（P<0.05）。参数固定法的细胞发光率均随辐照声强、时间和造影剂浓度的增加而增加。两种方法的细胞存活率均呈随辐照声强、时间和造影剂浓度的增加而降低的变化趋势（P<0.05）。两种实验组合方法所获得的前列腺癌细胞适宜辐照条件均为声强0.9w∕cm2、时间40s、造影剂浓度20％。
　　 结论：随机组合与参数固定两种方法在探索前列腺癌细胞超声辐照后其细胞通透性和死亡率中有大致相同的趋势，并获得相同的适宜辐照条件。参数固定法是一种研究前列腺癌细胞超声辐照适宜条件的简便可行方法。
　　 第四章应用参数固定法对人前列腺癌两种细胞的辐照参数优化研究
　　 目的：以参数固定法探讨PC3细胞和LNcap细胞的最适宜辐照条件并比较最适宜辐照条件对两种细胞通透性和存活率的影响。
　　 方法：分别以声强组、时间组和造影剂浓度组的辐照参数辐照两种细胞。声强组细胞分别以声强0.6w∕cm2，0.9w∕cm2和1.2∕cm2辐照。时间组细胞分别以时间10s，20s和40s进行辐照。造影剂浓度组细胞分别以微泡造影剂浓度10％, 20％和30％进行辐照。以流式细胞仪测细胞发光率，以台盼蓝拒染法测细胞存活率。比较细胞的发光率和存活率，并以发光率最高且存活率大于75％为标准来探讨两种细胞的最适宜辐照条件。
　　 结果：随着声强的增加，PC3细胞和LNcap细胞的发光率均呈不断上升的趋势（P<0.01），而两种细胞的存活率均呈不断下降的趋势（P<0.05），最适宜的辐照声强为0.9w∕cm2。随着辐照时间的增加，两种细胞的发光率均逐渐增加（P<0.01），存活率则逐渐降低（P<0.05），最适宜的辐照时间为40s。随着造影剂浓度的增加，两种细胞的发光率先逐渐增加而后基本保持不变，存活率均随造影剂浓度的增加而不断下降（P<0.05），最适宜的造影剂浓度均为20％。两种细胞的最适宜辐照条件为声强0.9w∕cm2、时间40s、造影剂浓度20％。PC3细胞在最适宜辐照条件下的发光率低于LNcap细胞（19.25±1.28％、21.47±1.51％；P<0.05），而存活率高于LNcap细胞（76.58±1.17％、75.02±0.84％；P<0.05）。
　　 结论：PC3细胞和LNcap细胞的适宜辐照条件均为辐照声强0.9w∕cm2、辐照时间40s、造影剂浓度20％。最适宜辐照条件对PC3细胞膜通透性和存活率的影响小于LNcap细胞。

目录

绪论

第一章 二次超声辐照和一次超声辐照对人前列腺癌两种细胞的通透性和存活率的影响

第二章 辐照声强、时间和造影剂浓度对人前列腺癌两种细胞的通透和存活率的影响

第三章 随机组合法和参数固定法对前列腺癌细胞辐照参数选择的比较研究

第四章 应用参数固定法对人前列腺癌两种细胞的辐照参数优化研究

附录 超声介导基因转染的研究现状

攻读硕士学位期间发表的论文

致 谢

论文说明：中英文名词缩略语表

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