子宫内膜相关芯片的通路富集分析及其在猪繁殖机理研究中的应用

摘要

繁殖性能对于养猪业而言,直接关乎生产成本,进而影响经济效益,意义重大。很多因素都会影响到猪繁殖性能。其中子宫内膜作为雌性生殖器官的一部分,是维持生理特征和生育功能的重要器官。子宫内膜具有高度增殖活性,然而它又极易受流产、感染、内分泌等多种因素的影响,导致子宫内膜的再生能力下降,容受性降低,严重影响繁殖力。基因芯片是后基因组学时代基因功能分析的重要技术之,已广泛地应用于人类疾病和模式生物复杂性状遗传机制的研究。南于基因芯片的成本高,微阵列的制备、样品的准备与标记比较繁琐,分析系统价格昂贵,信号的假阳性率高等,使得该技术的普及与推广存在一定的难度。而且基因芯片的分析及注释需要较完备的基因组序列信息,使之在猪等家畜中的应用受到极大的限制,许多研究者只能应用低密度微阵列或跨物种基因芯片进行相关研究。在猪等农业动物的研究方面,虽然应用基因芯片已检测出许多与重要经济性状、疾病等相关的基因,但就这些基因在猪的生长发育过程和疾病发生发展中所担任的角色、相互作用机制仍未完全明确。因此对猪的遗传育种,可以从比较基因组学的角度出发,利用人及小鼠等模式生物的全基因组信息,对其进行服务。
　　 对子宫内膜相关疾病和异常的全基因组研究,在人及牛等其它物种上,积累了不少数据,而且注释信息完整。因此,我们可以通过对已有的人、牛相关芯片数据进行分析整合,再通过比较基因组学的办法进行同源基因比对,以期得到影响猪子宫内膜的关键通路和候选基因。为进一步研究影响猪繁殖性能的分子遗传机制和分子标记辅助选择育种奠定基础。
　　 本论文的研究工作主要包括以下内容:
　　 1.子宫内膜异位症芯片数据的通路富集分析及整合
　　 首先将从公共数据库中收集到的相关数据,采用统一的预处理方法进行处理,然后应用基因集富集分析方法对子宫内膜异位症相关的微阵列数据进行分析,最后对每套的结果进行整合分析。结果表明,在卵巢型的3套数据集中,发现17个共同上调的通路和23个共同下调的通路。在腹膜型的2套数据中,有26个上调通路是一致的,有1个下调通路是一致的。比较这两种类型的分析结果,发现有13个相同的上调通路和1个相同的下调通路。这些通路主要与免疫疾病和免疫系统相关。对子宫周期的数据分析结果表明,分泌早期有12个显著上调通路和18个显著下调通路,分泌中期没有显著上调通路,只有29个显著下调通路。对3个时期得到的通路进行比较,发现彼此之间交集很少。对以子宫内膜内皮细胞为样本的数据进行基因集富集分析,得到46个显著上调通路和1个显著下调通路。将其与以上结果比较,得到2个共同通路。通过GSEA方法得到的上述结果更容易解释也更可靠,提高了微阵列实验结果的可重复性,为后续实验验证指出了方向,并为在分子水平上研究猪繁殖机理提供了参考通路和基因。
　　 2.能量负平衡对子宫内膜相关通路及基因的影响
　　 研究日粮能量水平对母猪子宫内膜的影响,对于合理饲养育成期母猪以及提高繁殖率和经济效益,都具有重要的意义。本研究利用GEO数据库中奶牛能量负平衡的微阵列表达数据,采用基因集富集分析的方法,筛选能量负平衡时,子宫内膜显著差异表达的相关通路和基因,。分析得到23个显著上调通路和26个显著下调通路。上调通路中,大部分是免疫系统和免疫性疾病相关通路。其中,Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路等7个通路是免疫系统相关通路,而原发性免疫缺陷、自身免疫性甲状腺疾病等5个通路与免疫性疾病相关。显著下调的通路中,主要是代谢相关通路、氧化磷酸化通路和细胞周期通路等。
　　 免疫性疾病相关通路,神经退行性疾病相关通路和生物合成相关通路最多。分别将这三类通路包括的基因进行比较,得到了相关的三个核心基因列表。与免疫性疾病相关的核心基因是BOLA,BOLA-DMA,BOLA-DMB,BOLA-DQA1,BOLA-DQA2,BOLA-DQA5,BOLA-DQB,BOLA-DRA,BOLA-DRB3,CD80,CD86,FAS,GZMB,LOC12672,LOC525727和PRF1;与神经退行性疾病相关的基因列表为ATP5F1,ATP5G1,ATP5G3,COX7A2,CYC1,NDUFA5。NDUFB2,NDUFB5,NDUFB7,NDUFC1,NDUFS6,NDUFS8,NDUFV1和UOCRB；与生物合成相关通路相关的核心基因列表为ALDOC,CS,DLD,IDH1,MDH2,PDHA1,PFKM,和PKM2。
　　 3.影响猪子宫内膜的候选通路及基因筛选
　　 通过分析疾病和能量对子宫内膜的影响,我们发现了很多共同的通路和基因。这些共同的通路可以作为研究猪子宫内膜的候选通路,而共同的基因,可以映射到猪的染色体上,作为影响猪子宫内膜的重要基因。我们将人卵巢型子宫内膜异位症芯片数据和能量负平衡数据的分析结果相比,发现相同的上调通路有12个和下调通路有10个。这22个通路可作为影响猪子宫内膜的候选通路,其中包含的同源基因是我们重点关注的基因。此外,PPAR信号通路仅在一套数据中小显著,也作为候选通路纳入结果中,共得到23个候选通路。对每个通路包括的基因进行提取,合并,去重复,共得到212个人Entrez基因。将这212个人的Entrez基因通过BioMart数据库,在猪染色体上寻找对应的同源基因,并对应到相应的染色体位置上。有比对结果的Entrez基因有168个,其中122个人Entrez基因对应140个猪Unigene同源基因,其它Entrez基因没有找到对应的猪unigene同源基因,但得到了相应同源基因在猪染色体上对应的起始位置。
　　 4.猪胚胎和子宫内膜发育相关内参基因的筛选
　　 胚胎发育到胎膜与子宫内膜附着是一个渐进的过程。人们对这一过程进行了很多研究,实时定量PCR因其快速可靠的特点已经成为分析基因转录水平的常用手段,通常使用看家基因进行相对定量。然而很多看家基因随着环境的改变其表达也会发生变化。而微阵列芯片数据包含了整个基因组的信息,可以供我们筛选在特定组织中稳定表达的基因,将其作为内参基因进行相对定量。我们应用元分析办法整合多套关于猪胚胎和子宫内膜发育的芯片数据,初步筛选出表达稳定的前100个候选内参皋因,大部分为编码核糖体蛋白的基因。
　　 综上所述,本文通过对人和牛相关芯片数据的分析,发现在疾病和能量差异情况下,在子宫内膜显著差异表达的相关通路和基因,并采用比较基因组学的方法,将所发现的相同通路和基因,映射到猪染色体上,并对应得到猪的同源皋因。这些通路和基因可作为影响猪子宫内膜的候选通路和基因,不仅可以对现有繁殖相关基因有更深入的了解,还有助于发现新的与繁殖性状相关的重要候选基因,为母猪繁殖性状标记辅助选择(MAS)和标记辅助导入(MAI)提供新的依据。最后,利用GEO数据库中与猪胚胎发育和子宫内膜相关的芯片,采用元分析方法,为RF-PCR的的准确使用提供候选内参基因。

目录

文摘

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答辩决议书

1 引言

1.1 研究背景

1.2 基因表达芯片及其常规分析方法

1.2.1 基因表达

1.2.2 基因芯片概念

1.2.3 实验设计

1.2.4 基因芯片数据校正

1.2.5 差异表达基因统计分析方法

1.2.6 聚类分析

1.2.7 信号解读与基因注释

1.3 基因集富集分析

1.3.1 基因集的定义

1.3.2 GSEA方法及其扩展

1.3.3 基因集富集分析的优点

1.4 元分析方法

1.4.1 合并P值的FISHER法

1.4.2 基于T模型的方法

1.4.3 秩积法(RANK PRODUCT APPROACH)

1.4.4 秩融合法(RANK AGGREGATION APPROACH)

1.5 比较基因组学

1.5.1 直向同源基因

1.5.2 比较基因组学的研究方法

1.5.3 全基因组的比较研究

1.6 内参基因

1.6.1 实时荧光定量PCR

1.6.2 理想内参基因的条件

1.6.3 内参基因稳定性的分析方法

1.6.4 基于微阵列的参考基因筛选

1.7 研究目的与意义

2 子宫内膜异位症芯片数据的基因集富集分析及整合

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 数据检索与收集

2.2.2 数据预处理

2.2.3 基因集富集分析

2.3 分析结果

2.3.1 影响卵巢型子宫内膜异位症的显著通路

2.3.2 影响腹膜型子宫内膜异位症的显著通路

2.3.3 子宫周期各个阶段表达显著的通路

2.3.4 人子宫内膜内皮细胞的差异表达通路

2.4 讨论

2.5 结论

3 能量负平衡对子宫内膜相关通路及基因的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 数据

3.2.2 筛选差异表达基因

3.2.3 基因集富集分析

3.3 分析结果

3.3.1 差异表达基因

3.3.2 通路富集分析

3.3.3 比较通路间的重叠部分

3.4 讨论

3.5 结论

4 影响猪子宫内膜的候选通路及基因筛选

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 数据

4.2.2 HOMOLOGENE数据库

4.2.3 BIOMART数据库

4.3 结果

4.3.1 人与牛同源基因比对结果

4.3.2 猪同源基因比对

4.4 讨论

5 猪胚胎和子宫内膜发育相关内参基因的筛选

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 数据收集

5.2.2 数据预处理

5.2.3 基因排序

5.2.4 元分析

5.2.5 基因注释

5.3 结果

5.4 讨论

6 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

附录

附录1 论文中应用的生物学相关软件以及数据库

附录2 词汇缩写列表

致谢

攻读博士学位期间发表或录用的论文