磷酸钙/聚合物复合纳米粒基因递送系统的研究

摘要

目的：制备一类可用于基因递送的非病毒载体——磷酸钙/聚合物复合纳米粒，并对其理化性质和体内外转染活性进行了研究，评价其应用于基因递送的可行性。
　　 方法：通过多种方法制备出高分子聚合物聚乙二醇-聚乳（mPEG-PLA）纳米粒、聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸-聚赖氨酸共聚物（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒、阳离子高分子脂质体羧甲基壳聚糖季铵盐纳米粒（CPL）以及二者分别与磷酸钙复合后的复合纳米粒。通过用粒径分析仪测定其粒径分布、表面电位(Zeta电位)，MTT试验研究壳聚糖纳米基因载体对人成纤维细胞L929、人卵巢癌细胞HO8901和人肝癌细胞HepG2的细胞毒作用，凝胶阻滞实验和体外细胞摄取对各种纳米粒进行初步筛选并确定DNA与纳米粒的最佳结合质量比。通过DNase l保护实验研究DNA复合纳米颗粒对所携带基因的保护作用。体外基因转染实验是本研究的核心部分，通过倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪、荧光素酶报道系统对纳米粒的转染活性进行定性和定量的评价，综合评估并优选出细胞毒性小且转染效率相对较高的纳米材料。通过考察纳米粒在不同荷瘤裸鼠中的组织分布，评价纳米粒在体内的转染效率和组织靶向性。
　　 结果：制备的纳米粒粒径均分布在100-150nm左右，且分布范围窄，大小均一。mPEG-PLA纳米粒、mPEG-PLGA-PLL纳米粒、CPL纳米粒表面均带有正电荷，而复合纳米粒的正电荷明显低于高分子纳米粒本身的电荷数。通过凝胶阻滞实验分析复合纳米粒结合DNA分子的能力。PLA -mPEG纳米粒和mPEG-PLGA-PLL纳米粒结合DNA能力较弱，CPL纳米粒具有相对较好的DNA结合能力，与磷酸钙复合后结合DNA的能力增强，其中CaP/OQCMC (0.1:1)（磷酸钙/十八烷基-羧甲基壳聚糖季铵盐）在质量比为1:2时,可以与DNA分子结合。通过MTT实验可知，mPEG-PLA和mPEG-PLGA-PLL在浓度为200μg/ml时细胞生存率仍为90％以上，二者细胞毒性较小。当OQCMC在20μg/ml时，L929细胞生存率在60-70％，而lipofectamine 2000已降至30％。OQCMC与磷酸钙复合后，其细胞毒性大大降低，安全浓度大大提高。CaP/OQCMC在浓度为500μg/ml时，L929细胞的生存率仍70％左右。CaP/OQCMC(0.2:1)纳米粒可迅速进入细胞，并在1h时达到顶峰，其细胞摄取存在时间依赖性。对于不同的细胞同样的纳米粒的优化转染条件是不同的。通过单因素分析和转染正交试验，得到293T、PC-3和MCF-7细胞的最佳转染条件。对于293T细胞，当质粒的量为0.8μg，DNA与CaP/OQCMC (0.2:1)纳米粒质量比为1:2，观察时间为72h时，转染强度最高。对于PC-3细胞，当质粒的量为1.6μg，DNA与CaP/OQCMC (0.2:1)纳米粒质量比为1:1，观察时间为96h时，转染强度最高。对于MCF-7细胞，当质粒的量为0.8μg，DNA与CaP/OQCMC (0.2:1)纳米粒质量比为1:1，观察时间为48h时，转染强度最高。十四烷基-羧甲基壳聚糖季铵盐（TQCMC）纳米粒通过尾静脉注射后，主要分布在肝脏，肾脏和肿瘤组织中，体现了TQCMC纳米的代谢途径，但是其组织内的富集并不高。这也说明了体内环境的复杂性。
　　 结论：磷酸钙/聚合物复合纳米粒能将基因递送到细胞内，并使报告基因在细胞内表达。因此，磷酸钙/聚合物复合纳米粒可以用作一种安全有效的基因递送的非病毒载体系统，其体内转染效果值得进一步研究。

目录

绪 论

第一章磷酸钙/聚合物复合纳米粒制备与表征

第二章 磷酸钙/聚合物复合纳米粒体外转染实验研究

第三章 阳离子高分子脂质体纳米粒的动物体内分布

结 语

参考文献

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