Nodosin预处理对大鼠移植肝细胞因子分泌的影响及缺血性损伤保护作用的研究

摘要

研究背景：随着免疫制剂治疗的开发，肝移植存活率有了明显的改善。
　　 然而，免疫排斥和缺血再灌注损伤仍然是影响移植物存活的最主要因素。以原位肝移植（OLT）为研究对象，根据前期研究的实验结果，选择溪黄草有效成分Nodosin，通过供肝药物保留灌注方法，采用病理学和细胞生物学方法比较不同组别肝脏病变，定量PCR方法检测肝脏内细胞因子的表达，为Nodosin在减轻大鼠原位肝移植术后损伤中的作用提供免疫学依据。
　　 第一部分、大鼠原位肝移植模型的建立
　　 目的:总结大鼠原位肝移植模型的手术经验，建立稳定的大鼠原位肝移植模型。
　　 方法:通过Kamada“二袖套法”，并作了相应的改进，施行大鼠原位肝移植。
　　 结果:供体手术时间为21-28min，供肝的修整及套管时间为10-16min，肝上下腔静脉吻合时间为8.5-l3min，无肝期为l7-23min。肝移植术后24 h存活率为86％(43／50)，死亡的5例中麻醉控制不当3例，出血3例，血栓形成1例；4天存活率80％(40／50)，死亡的3例中胆道梗阻1例，胆漏2例。
　　 结论:改良的两袖套法具有操作简便、无肝期短、手术成功率高的优点，是大鼠原位肝移植的理想术式。熟练的显微外科技术和细心轻柔的操作, 可提高原位肝移植大鼠的成活率，为实验研究提供了高效、稳定的动物模型。
　　 第二部分、Nodosin预处理对术后早期移植肝细胞因子分泌的影响及缺血性损伤保护作用的研究
　　 目的:通过测定细胞因子和ET-1在大鼠移植肝中表达的变化，探讨溪黄草有效成分Nodosin预处理供肝进行原位肝移植后，提高移植肝保护作用的免疫学机制。
　　 方法:将实验雄性Wistar大鼠随机分为4组(n=6)：空白对照组、Nodosin处理实验组、阳性对照组(Copp组)和阴性对照组(Znpp组)。实验动物经门静脉灌注各组实验药物，各组供肝于灌注后1h行原位肝移植至SD大鼠，并分别在移植手术后第1、4天处死大鼠，切取肝脏组织标本, 测定供肝组织细胞凋亡水平、血清谷草转氨酶(AST)水平和病理Suzuki标准评价I/R损伤的病理表现。采用常规的逆转录（reverse transcription, RT）-实时荧光定量PCR（real-time quantitativePCR）的方法检测重要细胞因子TNF-α、IL-10、 INF-γ和内皮素-1（ET-1）在不同组别处理移植肝脏中的表达。
　　 结果:供肝保留灌注Nodosin后，采用TUNEL方法比较测定肝移植术后24h供肝细胞凋亡情况，结果显示实验组Nodosin组和阳性对照组Copp组中每个视野大概有1-2个凋亡细胞，而在空白对照组和阴性对照组Znpp组中每个视野大概有15-50个凋亡细胞。
　　 肝移植术24h后肝脏病理损伤情况，结果显示空白对照组中，病理可见明显的肝细胞气球样变和汇管区水肿，以及小叶结构的破坏（Suzuki’s score = 2.83± 0.75）。阴性对照组Znpp组中，病理不仅可见明显的肝细胞气球样变、汇管区水肿、小叶结构的破坏，甚至出现区域性的坏死（Suzuki’s score = 3.33 ±0.58）。然而，在实验组Nodosin组和阳性对照组Copp组中，病理仅可见少量中性粒细胞浸润和细胞轻度水肿，未发现明显的充血和坏死现象（Nodosin组Suzuki’s score = 1.33 ± 0.52 & Copp组Suzuki’s score = 1.66 ± 0.82，vs 空白对照组 p< 0.05）。
　　 肝移植术后24h受体血清AST含量情况：结果显示实验组Nodosin组的血清AST含量明显低于空白对照组（Nodosin组2434 ± 739 IU/L ，vs 空白对照组3946 ±831 IU/L，P<0.01）。
　　 采用实时定量PCR检测不同处理组移植肝原位重要细胞因子TNF-α、IL-10、INF-γ的表达，结果显示经Nodosin处理后的大鼠肝脏中，TNF-α的含量低于空白对照组和阴性对照组，其中在Day1 Nodosin组中细胞因子的含量降低具有统计学意义（Nodosin组0.89±0.39，vs 空白对照组2.00±0.51 & 阴性对照组2.20±0.12 ,P<0.05）。
　　 细胞因子INF-γ的检测结果显示经Nodosin处理后的大鼠肝脏中， IFN-γ的含量低于空白对照组和阴性对照组，其中在Day1 Nodosin组中细胞因子的含量降低具有统计学意义（Nodosin组0.84±0.39，vs 空白对照组2.11±0.40 & 阴性对照组2.11±0.73 ,P<0.05）。
　　 而具有免疫负向调节作用的细胞因子IL-10在原位肝脏移植后的第四天均出现升高，而预先进行Nodosin灌注后，IL-10的升高更为显著，表明Nodosin作用后，免疫系统可以通过上调IL-10的表达起到免疫应答的负向调节作用。
　　 和病理结果项一致，参与肝脏损伤的重要分子ET-1的检测结果显示在移植后第1天，内皮素的表达上升很快，但是经Nodosin处理后，虽然内皮素的表达也有增加，但是和空白对照组、阴性对照组相比，升高的幅度明显减少；而在第四天时，药物处理组的内皮素表达进一步下降，表明Nodosin的处理可以减缓内皮素的表达，从而有效减少移植肝脏的损伤。
　　 结论:Nodosin预处理供肝后，可以明显降低供肝细胞的凋亡率，肝脏病理性受损改善，可以在移植早期明显降低促炎型的细胞因子(TNF-α和INF-γ)在移植肝脏中的原位表达，促进调节性细胞因子IL-10的表达升高，并伴随后ET-1的表达下降，提示Nodosin改变了移植肝局部的细胞因子的分泌和血管损伤因子的表达，从而对移植肝起到保护作用。

目录

第一部分 大鼠原位肝移植模型的建立

第二部分 Nodosin 预处理对术后早期移植肝细胞因子分泌的影响及缺血性损伤保护作用的研究

参考文献

附录肝移植中细胞因子的表达

致谢

作者攻读学位期间发表的论文

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