人羊水克隆样细胞来源干细胞与生物可降解材料体内外构建组织工程膀胱平滑肌的实验研究

摘要

目的：探讨孕中期羊水作为一种新的干细胞来源的可行性以及体外高效地诱导人羊水克隆样细胞来源干细胞向平滑肌样细胞的诱导分化，评估细胞与聚羟基乙酸(polyglycolic acid，PGA)支架复合物的生物相容性，由此探讨该复合物用于组织工程膀胱平滑肌重建的可行性。
　　 方法：孕中期B 超引导下穿刺抽取羊水，体外机械法分离挑选原代人羊水克隆样细胞来源干细胞（Human Amniotic Fluid Colony-derived Stem Cells，hAFCSCs），取第3 代细胞用肌源性生长因子(血小板衍生生长因子：platelet derivedgrowth factor BB, PDGF-BB 和转化生长因子：Transforming growth factorβ1,TGF-β1)和左旋维生素C(L-Ascorbic acid，L-AA)在体外分别诱导分化3周，4 周和5 周，然后光镜下观察诱导后细胞生长的形态变化,免疫荧光细胞染色和RT-PCR 检测平滑肌细胞的标志物。取第4 代人羊水克隆样细胞来源干细胞种植到非编织PGA 材料上，体外诱导培养4 周后移植到裸鼠背部皮下，4 周后取材进行体内外种植效果的评价。
　　 结果：免疫荧光和RT-PCR 显示运用机械法成功分离鉴定hAFCSCs，并建立人羊水干细胞系，细胞可以持续传代。hAFCSCs 体外增殖能力强， RT-PCR,免疫荧光细胞染色显示经诱导的hAFCSCs 表达平滑肌细胞的标志物平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA），肌钙蛋白（calponin，CALP），平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)和肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC)。PGA 支架上的hAFCSCs 在种植4h 后开始正常贴附、生长和增殖，细胞形态良好。扫描电镜显示hAFCSCs 紧密贴附到PGA 支架材料上并分泌细胞外基质。
　　 冰冻切片免疫荧光染色显示组织块中表达平滑肌细胞的标志物。生物力学检测显示，细胞-PGA 支架复合物在力学指标上具有和正常膀胱平滑肌组织类似的力学拉伸特性，虽然其同正常的膀胱平滑肌组织相比在最大载荷上仍然存在一定差距，但同单纯PGA 支架相比，力学优势非常明显，其差异具有统计学意义。
　　 结论：采用机械分离法可以从孕中羊水培养体系中分离出hAFCSCs，这些细胞具有相似的形态和干细胞表面标志物。hAFCSCs 能在肌源性生长因子(PDGF-BB 和TGF-β1)和左旋维生素C(L-AA)的诱导作用下高效地分化为平滑肌样细胞。复合hAFCSCs 的PGA 支架复合物具有良好的生物组织相容性及良好的力学特性，表明以hAFCSCs 为种子细胞、PGA 为支架构建组织工程膀胱平滑肌组织具有可行性。

目录

绪论

第一部分 人羊水克隆样细胞来源干细胞的分离培养及鉴定

第二部分 人羊水克隆样细胞来源干细胞向平滑肌样细胞的诱导分化及鉴定

第三部分 组织工程膀胱平滑肌组织的构建

全文总结

文献综述：膀胱组织工程中平滑肌种子细胞来源的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

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