PPARγ激动剂对脂多糖诱导肾小管上皮细胞分泌趋化因子的影响及机制研究

摘要

肾间质炎症反应是导致肾间质纤维化的重要因素，在肾脏病进展过程中发挥着非常重要的作用。研究表明，包括白介素-8（interleukin-8, IL-8）和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1, MCP-1）在内的趋化因子与肾间质炎症损伤有关。在糖尿病大鼠和5/6肾切除大鼠模型中，肾间质IL-8和 MCP-1表达显著增加。肾脏固有细胞之一--肾小管上皮细胞，在结构上与小管液和肾间质紧密接触, 研究显示在细胞因子及刺激物作用下通过分泌趋化因子而积极参与肾间质病变，被认为是肾间质趋化因子的主要来源之一。HK-2细胞是人近端肾小管上皮细胞系，保留了肾小管上皮细胞的基本形态和生物学特性。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（γ，PPARγ）是一类配体依赖性核转录因子超家族成员之一，15-脱氧前列腺素J2（J2, 15d-PGJ2）和罗格列酮（RGL）分别是PPARγ的天然激动剂和人工合成激动剂。近年来，在糖尿病肾病和非糖尿病肾病动物模型中均发现PPARγ激动剂可减轻肾间质炎症反应，延缓肾间质纤维化过程。PPARγ激动剂减轻肾间质炎症反应是否与抑制肾小管上皮细胞分泌趋化因子有关及进一步分子机制尚未探明。脂多糖(LPS)是一种重要的致炎因子，可导致内毒素血症，加快狼疮性肾炎和IgA肾病动物模型的肾脏损害。
　　 本研究以肾小管上皮细胞（HK-2细胞）为研究对象，观察15d-PGJ2对LPS诱导的趋化因子表达的影响。结果提示：与对照组相比，单独LPS刺激4h使IL-8和MCP-1mRNA分别升高（5.27±1.83）和(5.04±1.33)倍。与单独LPS组相比，15d-PGJ2+LPS组IL-8和MCP-1mRNA分别下降74.23％和79.42％；肾间质炎症反应是导致肾间质纤维化的重要因素，在肾脏病进展过程中发挥着非常重要的作用。研究表明，包括白介素-8（IL-8）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）在内的趋化因子与肾间质炎症损伤有关。在糖尿病大鼠和5/6肾切除大鼠模型中，肾间质IL-8和 MCP-1表达显著增加。肾脏固有细胞之一--肾小管上皮细胞，在结构上与小管液和肾间质紧密接触, 研究显示在细胞因子及刺激物作用下通过分泌趋化因子而积极参与肾间质病变，被认为是肾间质趋化因子的主要来源之一。HK-2细胞是人近端肾小管上皮细胞系，保留了肾小管上皮细胞的基本形态和生物学特性。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（γ，PPARγ）是一类配体依赖性核转录因子超家族成员之一，15-脱氧前列腺素J2（J2, 15d-PGJ2）和罗格列酮（RGL）分别是PPARγ的天然激动剂和人工合成激动剂。近年来，在糖尿病肾病和非糖尿病肾病动物模型中均发现PPARγ激动剂可减轻肾间质炎症反应，延缓肾间质纤维化过程。PPARγ激动剂减轻肾间质炎症反应是否与抑制肾小管上皮细胞分泌趋化因子有关及进一步分子机制尚未探明。以往研究已显示，15d-PGJ2可抑制TNF-α诱导巨噬细胞/单核细胞分泌诱导性一氧化氮合酶（iNOS）和白介素-6（Interleukin -6，IL-6）等炎症介质，这一作用是否依赖于PPARΓ研究较少。为了进一步研究15d-PGJ2对肾小管上皮细胞分泌趋化因子的影响是否依赖于PPARΓ，本研究第二部分用RNAi技术沉默HK-2细胞中PPARΓ表达。实验结果显示：在PPARΓ沉默的HK-2细胞中，PPARΓ蛋白表达量是正常HK-2细胞的27.74％， 15d-PGJ2预处理2h仍能显著抑制LPS所致的IL-8和MCP-1表达增加，与单独LPS组相比， 细胞中IL-8 和MCP-1mRNA分别下降59.21％和44.08％；培养上清中IL-8和MCP-1分别下降47.11％和39.40％（均p<0.05）。研究发现15d-PGJ2可显著抑制LPS诱导的IκB磷酸化和NF-κB核易位，且此抑制作用不依赖于PPARΓ。表明15d-PGJ2作用于HK-2细胞，可直接抑制LPS诱导的IκB磷酸化，减少IκB的泛素化降解，进而抑制NF-κB核易位，减少下游IL-8和MCP-1转录，且以上作用不依赖于核受体PPARγ。本研究还发现RGL的抗炎机制与15d-PGJ2不同：在PPARγ沉默的HK-2细胞中，与单独LPS组相比，RGL+LPS组 IL-8 mRNA和蛋白仅分别下降18.16％和11.39％，MCP-1mRNA和蛋白仅分别下降16.83％和11.86％，差异均无统计学意义。且RGL对LPS诱导的IκB磷酸化和NF-κB核易位无明显影响。NCoR（nuclear receptor corepressor）属于核受体辅抑制因子，与PPARγ结合抑制其转录活性。本研究第三部分用特异性siRNA沉默肾小管上皮细胞NCoR，观察NCoR对RGL抑制趋化因子表达的影响。结果显示在NCoR沉默的HK-2细胞中，与对照组相比，单独LPS 组IL-8和MCP-1表达均显著增加（p<0.001）；与单独LPS刺激相比，RGL+LPS组IL-8 mRNA和蛋白仅分别下降32.22％和19.33％，MCP-1 mRNA和蛋白分别仅分别下降11.83％和10.77％，差异无统计学意义。提示沉默NCoR可抵消RGL对趋化因子表达的抑制作用。以往研究表明NCoR/HDAC3复合体从NF-κB的DNA结合位点解离对于激活NF-κB靶基因转录是必需的。研究表明肝X受体(LXRs)和糖皮质激素受体(GR) SUMO化(SUMO)，可抑制NCoR被19S蛋白酶体降解，进而抑制NCoR/HDAC3复合体从NF-κB靶基因启动子区清除，发挥抗炎作用。本研究表明，RGL显著降低NF-κB DNA结合活性，且可显著抑制LPS诱导的NCoR降解。提示RGL抑制趋化因子表达的作用依赖于NCoR，即RGL激活 PPARγ后抑制NCoR的降解，使NCoR/HDAC3复合体稳定结合于NF-κB的DNA结合位点，进而阻断NF-κB介导的炎症因子转录。PPARγ分子结构也存在SUMO化位点，在信号转导和转录激活子（STAT1）的抑制蛋白1(PIAS1)作用下发生SUMO化。为进一步观察RGL抑制趋化因子表达的作用是否与PPARγ SUMO化有关，本研究用特异性siRNA沉默HK-2细胞PIAS1表达。结果显示，在PIAS1沉默的HK-2细胞中，与对照组相比，单独LPS组IL-8和MCP-1表达均显著增加；与单独LPS刺激相比，RGL+LPS组IL-8mRNA和蛋白水平仅分别下降27.41％和13.33％，MCP-1 mRNA和蛋白仅分别下降20.16％和7.7％，差异无统计学意义。可见阻断PPARγ SUMO化， RGL的抗炎作用明显被抑制，提示RGL的抗炎机制与LXRs和GR相似，即RGL激活PPARγ SUMO化，抑制NCoR被蛋白酶体降解，使NCoR稳定结合于NF-κB 的DNA结合位点，抑制下游炎症因子转录。
　　 本研究首次证实PPARγ激动剂可显著抑制LPS诱导肾小管上皮细胞分泌IL-8和MCP-1。PPARγ天然激动剂--15d-PGJ2可直接抑制LPS诱导的IκB磷酸化，进而阻断NF-κB核易位，以上作用不依赖于PPARγ。与15d-PGJ2不同，PPARγ人工合成激动剂--RGL对趋化因子的抑制作用依赖于PPARγ，对NF-κB核易位无明显影响，而是通过激活PPARγ，促进其SUMO化，进而抑制NCoR降解，使NCoR/HDAC3稳定结合于NF-κB的DNA结合位点，阻断下游炎症因子转录。本研究为解释PPARγ激动剂抑制肾间质炎症反应提供了新的理论依据。

目录

前 言

第一部分 PPARγ激动剂对脂多糖诱导肾小管上皮细胞分泌趋化因子的影响

第二部 PPARγ激动剂抑制脂多糖诱导肾小管上皮细胞分泌趋化因子的机制研究

第三部分 核受体辅抑制因子对罗格列酮抑制肾小管上皮细胞分泌趋化因子的影响及机制研究

结论

参考文献

在读期间发表和撰写文章及学术会议投稿

致谢

附录综述 过氧化物酶体增殖物激活受体-γ和肾脏纤维化研究新进展

论文说明：图表目录、缩略语表

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