功能性超支化聚合物药物载体的构建及应用

摘要

超支化聚合物是一类具有准球形结构的高度支化大分子，具有大量的内部空穴和很多末端官能团。超支化聚合物由于其独特的结构和性能特点，已成为高分子领域的研究热点。经过近20年的发展和探索，人们在超支化聚合物的合成、结构表征、功能化改性等方面已经取得了重要进展，尤其是超支化聚合物的合成方法已经趋于全面和成熟，这为超支化聚合物的应用开发奠定了坚实的基础。近年来，超支化聚合物在生物医用领域的应用开始崭露头角。在这些新生的交叉领域中，基于超支化聚合物的药物输送体系构建尤其受到关注。在本文中，我们基于分子设计，通过对现有合成方法的组合和优化，制备了一系列功能性的超支化聚合物，并对它们作为药物载体的应用研究进行了一系列细胞层次的评估。具体研究内容和主要结论如下:
　　1.超支化聚乙二醇(HPEG)的合成、表征及其作为药物载体的体外评估
　　聚乙二醇(PEG)是一类性能优异的生物材料，在药物输送等领域已引起人们广泛的关注。但是传统的线型PEG只有两个末端，大大限制了其药物负载量及多功能输送系统的构建。我们采用商业化的甲基丙烯酸缩水甘油酯和PEG，在氢化钾的催化下，利用质子转移聚合合成了HPEG。利用核磁共振(NMR)，凝胶渗透色谱(GPC)，傅立叶变化红外光谱(FTIR)和差示扫描量热(DSC)技术对HPEG的结构和性能进行了系统的表征。通过NMR结果对HPEG进行了归属，并计算了支化度。
　　利用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染评估了HPEG对小鼠成纤维细胞(NIH/3T3细胞)的细胞毒性，用溶血实验对HPEG的溶血性能进行了测定。采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜对HPEG孵育的人宫颈癌细胞（Hela细胞）的细胞内摄性能进行了表征。将甲氨蝶呤(MTX)作为模型药物缀接到HPEG末端，得到了HPEG-MTX前药，并通过MTT测定了HPEG-MTX对Hela细胞的生长抑制效果。
　　2.阳离子型超支化聚酯胺的合成及前药构建
　　以商业化的三乙醇胺、甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，在氢化钾的催化下一步合成制备了阳离子型超支化聚酯胺。通过改变单体和催化剂的投料比，得到了一系列具有不同支化度和ζ电位的超支化聚酯胺。利用NMR、FTIR、动态光散射(DLS)、GPC、DSC和ζ电位等技术对其结构和性能进行了表征。NMR计算表明超支化聚酯胺支化度在0.47-0.68之间。ζ电位在2.1-7.1之间。
　　利用MTT方法评估了超支化聚酯胺对NIH/3T3细胞的细胞毒性。结果显示超支化聚酯胺具有很低的细胞毒性。用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜测试了人乳腺癌细胞（MCF-7细胞）对超支化聚酯胺的细胞内摄行为，将苯丁酸氮芥缀接到超支化聚酯胺上，得到了超支化聚酯胺-苯丁酸氮芥前药。MCF-7细胞的MTT测定表明，超支化聚酯胺-苯丁酸氮芥前药能够显著抑制肿瘤细胞的生长。
　　3.温度响应性超支化聚酯胺的设计合成及其作为药物载体的评价
　　通过质子转移聚合，一步合成得到分子骨架温度响应性的超支化聚酯胺。利用NMR、GPC、FTIR和DSC技术对超支化聚酯胺的分子结构进行了系统表征，并采用DLS技术测定了聚合物水溶液的温度诱导相转变。DLS结果表明，可以通过控制单体的投料比将超支化聚酯胺的最低临界溶液温度(LCST)控制在37到57℃。
　　进一步用MTT测试、流式细胞仪和激光共聚焦显微镜对材料的细胞毒性和细胞内摄进行了评估，结果显示超支化聚酯胺对非洲绿猴肾细胞（COS-7细胞）的毒性极低且可以被COS-7高效摄取。借助其温度响应性，超支化聚酯胺在LCST以上可以将疏水药物分子如阿霉素(DOX)包裹起来，利用透射电子显微镜(TEM)和DLS测试了负载了DOX的超支化聚酯胺的形态。体外药物释放实验结果显示，该类药物输送体系在生理条件下稳定、弱酸性条件下可以迅速释放药物，从而成功构建了环境响应性的药物输送体系。
　　4.生物还原型超支化多臂共聚物单分子胶束的构建及其药物控制释放
　　通过分子设计合成了一种基于超支化聚酯(H40)为核、二硫键连接的聚左旋乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)嵌段聚合物为壳的两亲性超支化多臂共聚物H40-star-PLA-SS-PEG。H40-star-PLA-SS-PEG在水溶液中形成单分子胶束，可用于构建药物输送系统。H40和PLA都是可以生物降解的脂肪族聚酯。PLA和PEG的分子质量可以在合成过程中控制，因此可以通过合成来调控H40-star-PLA-SS-PEG的分子尺寸以及药物的负载和释放。此外，PEG使胶束在生理环境下稳定存在，增加胶束的稳定性并延长了体内循环时间。在还原刺激下，二硫键的断裂促使PEG脱离，胶束解体，快速释放出负载的药物。该系统克服了传统自组装胶束在体内低浓度下的不稳定性，同时能够对肿瘤细胞内的谷胱甘肽酶(GSH)产生响应快速释放出所负载的药物，是一种理想的生物刺激响应型药物输送体系
　　5.温度、pH双响应性超支化聚醚胺的合成表征和性能研究
　　采用商品化的三乙醇胺和1，2，7，8-二环氧辛烷为单体，在氢化钾催化下，通过质子转移聚合一步合成了一系列温度和pH双响应的超支化聚醚胺。用NMR、FTIR、GPC、DSC和ζ电位对超支化聚醚胺的结构进行了详细的表征。通过NMR计算得到超支化聚醚胺的支化度在0.40-0.49之间。用变温紫外-可见光谱(UV-vis)测定了超支化聚醚胺的LCST，并考察了超支化聚醚胺的浓度和溶液的pH值对其LCST的影响。结果显示超支化聚醚胺水溶液具有温度和pH双重响应性，通过控制聚合物的组成和聚合物在水溶液中的浓度可以调控其LCST。
　　利用MTT方法评估了超支化聚醚胺对NIH/3T3细胞的细胞毒性。结果表明温度和pH双响应的超支化聚醚胺的细胞毒性很低。流式细胞仪和激光共聚焦显微镜测试结果表明，超支化聚醚胺具有良好的细胞内摄性能。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 超支化聚合物作为药物载体的研究概述

1．2．1 聚合物-药物复合物

1．2．2 单分子胶束药物输送体系

1．2．3 多分子胶束药物输送体系

1．2．4 环境响应性胶束药物输送体系

1．2．5 聚合物-药物缀合物

1．3 超支化聚合物的功能化

1．3．1 单单体法

1．3．2 双单体法

1．4 超支化聚合物的基本结构参数

1．4．1 支化度

1．4．2 分子量及分子量分布

1．5 本论文的意义和主要研究内容

第二章 超支化聚乙二醇的合成、表征及其作为药物载体的体外评估

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验原料、仪器及设备

2．2．2 合成

2．2．3 HPEG的表征

2．2．4 HPEG的降解

2．2．5 细胞实验

2．3 结果与讨论

2．3．1 HPEG的合成

2．3．2 HPEG的表征

2．3．3 HPEG的降解性能和细胞毒性

2．3．4 细胞内摄测定

2．3．5 载药及抗肿瘤性能测试

2．4 结论

第三章 阳离子型超支化聚酯胺的合成及前药构建

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验原料，仪器及设备

3．2．2 合成

3．2．3 阳离子型超支化聚酯胺的表征

3．2．4 阳离子型超支化聚酯胺的降解

3．2．5 细胞实验

3．3 结果与讨论

3．3．1 超支化聚酯胺的合成

3．3．2 超支化聚酯胺的表征

3．3．3 阳离子型超支化聚酯胺的降解

3．3．4 细胞实验

3．4 结论

第四章 温度响应性超支化聚酯胺的设计合成及其作为药物载体的评价

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验试剂、仪器及设备

4．2．2 合成

4．2．3 温度响应性超支化聚酯胺的表征

4．2．4 热诱导相转变

4．2．5 细胞实验

4．2．6 酸敏感药物释放

4．2．7 对肿瘤细胞生长抑制效果的测定

4．3 结果与讨论

4．3．1 温度响应性超支化聚酯胺的合成

4．3．2 温度响应性超支化聚酯胺的表征

4．3．3 热诱导相转变

4．3．4 细胞实验

4．3．5 药物负载及酸敏感的药物释放

4．3．6 负载了DOX的超支化聚酯胺对肿瘤细胞的生长抑制

4．4 结论

第五章 生物还原型超支化多臂共聚物单分子胶束的构建及其药物控制释放

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 实验试剂、仪器及设备

5．2．2 合成

5．2．3 聚合物的表征

5．2．4 聚合物的性能测定

5．3 结果与讨论

5．3．1 H40-star-PLA-SS-PEG的合成

5．3．2 聚合物的表征

5．3．3 H40-star-PLA-SS-PEG单分子胶束的结构及其对还原环境的响应性

5．3．4 DOX的负载以及释放行为研究

5．3．5 负载了DOX的H40-star-PLA-SS-PEG胶束细胞内DOX的释放研究

5．3．6 负载了DOX的H40-star-PLA-SS-PEG胶束对Hela细胞的生长抑制效果

5．4 结果与讨论

第六章 温度／pH双响应性超支化聚醚胺的合成、表征和性能研究

6．1 引言

6．2 实验部分

6．2．1 实验试剂、仪器及设备

6．2．2 合成

6．2．3 超支化聚醚胺的表征

6．2．4 细胞实验

6．3 结果与讨论

6．3．1 超支化聚醚胺的合成

6．3．2 超支化聚醚胺的表征

6．3．3 超支化聚醚胺的温度和pH响应性

6．3．4 细胞实验

6．4 结论

第七章 全文总结

7．1 全文的主要内容和结论

7．2 本文主要创新点

参考文献

致谢

攻读博士期间发表的学术论文