肠道菌群结构变化与结直肠癌发生发展关系的研究

摘要

结直肠癌是发生在人体下消化道结肠或直肠部位的恶性肿瘤。在世界范围内，其发病率和死亡率均位居各种癌症的前三位，对人类健康构成巨大的威胁。近几十年来，流行病学调查和分子、细胞生物学研究都表明，饮食是影响结直肠癌发病率的最重要因素。而饮食成分对癌症的影响，则很大程度上通过人体肠道细菌的代谢活动来达成。肠道菌群以人体内的营养成分维持生存和代谢，与人体共同对外界的环境因素做出反应，进行代谢和免疫活动，维持人体健康。人体健康受损和疾病的发生发展，与肠道菌群结构和功能的失调密切相关。因此，本论文的研究目的是通过动物模型和人群群组研究等手段，研究在结直肠癌的发生发展过程中肠道菌群的变化规律，用以更好地理解肠道菌群对于维持人体健康的重要意义。
　　首先，我们以化学致癌剂1，2-二甲肼诱导大鼠结肠内发生癌前病变异常隐窝病灶(ACF)，选取此过程中的两个时间点对大鼠的肠道菌群结构进行分析。我们用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)和本论文所建立的荧光核糖体RNA基因限制性片段分析(f-DRT)这两种DNA指纹图谱技术，以及454焦磷酸测序技术结合多变量统计学方法对细菌16S rRNA基因序列多样性进行描述，并用以代表肠道菌群的多样性。主成分分析(PCA)和UniFrac主坐标分析(PCoA)结果显示，在化学致癌剂注射的一周后，造模组大鼠的肠道菌群整体结构与未造模对照组并没有明显差异;在注射七周之后，造模组大鼠的体重、脾重等健康指标与对照组大鼠没有明显差异，而结肠内出现了明显的ACF（37.7±2.6个/全结肠）。此时该组动物的肠道菌群整体结构相对于未见明显ACF的对照组，也显示出了显著的差异。根据454测序数据建立偏最小二乘法判别模型(PLS-DA)，我们找出了13个在区分两组动物肠道菌群中起到显著作用的细菌类群。这其中，有一类细菌与卵形瘤胃球菌（Ruminococcusobeum）具有99.3％的序列相似度，另一类与Allobaculum stercoricanis具有93.7％的序列相似度，它们在发生了结肠ACF的造模组大鼠肠道菌群中的丰度显著高于对照组(p＜0.05)，与本实验室用变性梯度凝胶电泳(DGGE)研究同一批样本得到的结论一致;而其他的11类细菌在造模组大鼠肠道菌群中的丰度则显著低于对照组(p＜0.05)。这部分实验结果表明，当动物肠道内发生极早期的癌前病变，而尚未对其健康状态造成明显影响时，其肠道菌群就已经发生了显著的变化。因此，肠道菌群的结构变化特征可能作为一项重要的生物学指标，用于对宿主的健康状态作出预测。而同时，癌前病变过程中，肠道菌群的这一类显著变化，即一些关键细菌种类的增加或缺失，可能在结肠癌的早期发展过程中起到一定的影响作用。
　　随后，我们通过针对上海常住居民的群组研究，对结直肠癌患者肠道菌群结构的特征进行了描述。本研究选取46例结直肠癌患者和56例健康对照志愿者的粪便样品作为研究对象，以454焦磷酸测序技术结合多变量统计学方法检测细菌16S rRNA基因V3区的多样性。我们发现，结直肠癌患者的肠道菌群整体结构与健康对照人群具有显著的差异，其中拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌在结直肠癌患者肠道中的数量显著偏低，而变形菌门(Proteobacteria)细菌则显著偏高。利用冗余分析(RDA)，我们找出了48个在两类人群肠道菌群结构的差异中最为关键的细菌类群。这其中，有4类细菌均属于拟杆菌属，但其变化特征并不一致:一类与脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）具有98.1％的序列相似度的细菌在结直肠癌患者肠道中丰度较高;而两类分别与普通拟杆菌（Bacteroidesvulgatus）具有100.0％和98.7％的序列相似度的细菌、以及一类与单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）具有97.5％的序列相似度的细菌则在健康个体肠道中丰度较高。另外，一些可能是条件致病菌的细菌在结直肠癌患者的肠道中丰度更高，它们分别属于肠球菌属（Enterococcus）、埃希氏杆菌/志贺氏杆菌属（Escherichia/Shigella）、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、链球菌属（Streptococcus）和消化链球菌属（Peptostreptococcus）等。而另一方面，产丁酸盐的罗氏菌属（Roseburia），以及毛螺菌科（Lachnospiraceae）的其他丁酸盐产生菌在健康个体肠道中丰度更高。我们还以人体内绝大部分丁酸盐产生菌的丁酸盐产生途径必需基因:丁酰-辅酶A辅酶A转移酶基因（Butyryl-coenzyme A CoA transferase gene）为分子标签，通过实时定量PCR的方法验证了结直肠癌患者肠道中丁酸盐产生菌数量的显著减少（Mann-Whitney检验，p＜0.01）。这部分实验结果表明，结直肠癌患者的肠道菌群相比于健康人，出现了整体失调的现象，而这一现象的主要特征就是对肠道健康有益的丁酸盐产生菌的减少，以及对健康有害的条件致病菌的增加。
　　综上所述，本论文通过动物模型研究发现，随着结肠内发生癌前病变ACF，大鼠的肠道菌群结构发生了显著的变化;而通过基于大规模人群的群组比较分析，也发现了结直肠癌患者中普遍存在着肠道菌群结构失调的现象。宿主肠道菌群结构的变化不但在结直肠癌发生的最早期阶段即已发生，而且可能伴随并影响结直肠癌的整个发生发展过程。本论文的研究成果提示，肠道菌群的结构变化可以作为一个灵敏的生物学指标，用于监测宿主健康状态，预测和评价宿主罹患结直肠癌的风险;而本论文所揭示的与结直肠癌相关的菌群结构变化特征也将有助于更深入地研究宿主和肠道菌群之间在代谢和免疫等方面的相互作用，并揭示菌群在结直肠癌发生发展过程中的作用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

引言

1．1 结直肠癌的研究现状

1．1．1 结直肠癌概述

1．1．2 结直肠癌的发生和发展

1．1．3 与结直肠癌发病相关的因素

1．2 肠道菌群与人体健康关系的研究

1．2．1 肠道菌群的组成

1．2．2 肠道菌群与宿主(人体)的相互作用

1．2．3 肠道菌群结构与功能的研究方法

1．2．4 多变量统计学在肠道菌群与健康相关研究中的应用

1．3 结直肠癌与肠道菌群关系的研究进展

1．3．1 促进结直肠癌发生的共生菌及其代谢物

1．3．2 抑制结直肠癌发生的共生菌及其代谢物

1．3．3 结直肠癌患者／高危人群的肠道菌群组成

1．3．4 益生菌／益生元对结直肠癌的预防和治疗作用

1．4 小结

参考文献

第二章 结肠癌癌前病变过程中大鼠肠道菌群结构的动态分析

摘要

ABSTRACT

引言

2．1 材料与方法

2．1．1 动物和采样

2．1．2 动物解剖及异常隐窝病灶(ACF)的测定

2．1．3 粪便样本总DNA的提取

2．1．4 16S rRNA基因全长扩增和V3区片段扩增

2．1．5 DNA指纹图谱分析

2．1．6 454测序及序列分析

2．1．7 多变量统计分析

2．1．8 重要OTU代表序列的登录号

2．2 实验结果

2．2．1 大鼠健康状况监测和结肠ACF计数

2．2．2 大鼠肠道菌群结构的动态监测

2．2．3 与两组大鼠肠道菌群结构差异密切相关的细菌种类的鉴定

2．2．4 454测序与DGGE结果的比较

2．3 讨论

2．4 本章小结与展望

参考文献

第三章 结直肠癌患者和健康人肠道菌群结构差异的比较研究

摘要

ABSTRACT

引言

3．1 材料与方法

3．1．1 志愿者招募及采样

3．1．2 DNA提取

3．1．3 16S rRNA基因V3高变区片段扩增和454测序

3．1．4 生物信息学和统计分析

3．1．5 实时定量PCR

3．1．6 核酸登录号

3．2 实验结果

3．2．1 序列多样性分析

3．2．2 结直肠癌患者和健康人肠道菌群在门水平上的比较

3．2．3 结直肠癌患者和健康人肠道菌群在门以下水平上的比较

3．2．4 实时定量PCR结果

3．2．5 结直肠癌患者与健康人肠道菌群整体结构的差异

3．2．6 和两组人群肠道菌群结构差异显著相关的细菌种类鉴定

3．3 讨论

3．4 本章小结与展望

参考文献

本论文的创新性

附录

致谢

学术论文、专利和参与的科研课题