Toll样受体4在百草枯致小鼠急性多脏器功能损伤的作用

摘要

第一部分百草枯中毒致多脏器功能损伤小鼠模型的建立
　　目的：筛选合适的染毒剂量，建立百草枯中毒致多脏器功能损伤小鼠模型，初步探讨百草枯中毒的剂量效应规律，为后期实验做准备。方法:30只清洁级C57BL/6小鼠随机分为五组，每组6只。A组：20mg/kg百草枯染毒组，B组：40mg/kg百草枯染毒组，C组：60 mg/kg百草枯染毒组，D组：80mg/kg百草枯染毒组,E组：100mg/kg百草枯染毒组。百草枯溶液腹腔注射染毒后第3天时计算各组死亡率，做HE染色观察肝、肾、肺组织损伤情况。
　　结果：20mg/kg百草枯染毒组小鼠染毒后3天小鼠无死亡，40mg/kg百草枯染毒组小鼠染毒后3天小鼠死亡率为16.7％，60mg/kg百草枯染毒组3天小鼠死亡率为33.3%，80mg/kg百草枯染毒组3天小鼠死亡率为83.3%，100mg/kg百草枯染毒组3天小鼠死亡率为100%。从病理学改变看，60mg/kg百草枯染毒组小鼠有明显的肺、肝、肾损伤，而40mg/kg百草枯染毒组有明显的肺损伤改变，肝肾损伤不明显。
　　结论：C57BL/6小鼠给予腹腔注射百草枯60mg/kg即可造成明显肝、肾、肺组织损害。并且随着小鼠腹腔注射百草枯的剂量增大，其存活率逐渐降低。
　　第二部分 Toll样受体4在百草枯致小鼠急性多脏器功能损伤的作用
　　目的：探讨Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)基因敲除对小鼠急性百草枯（PQ）中毒血清、肺组织炎症指标的影响，并且观察急性百草枯中毒后肝肾肺组织病理变化。
　　方法：野生型 C57BL小鼠和 Tlr4-/-C57BL小鼠分别随机分为空白对照（NS）组，百草枯处理组。NS对照组给予生理盐水60mg/kg腹腔注射，百草枯组给予百草枯60mg/kg腹腔注射。染毒后6h，24h，3d利用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE)染色法观察小鼠肝肾肺组织病理改变，酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法测定血清中白介素–6(interleukin–6，IL–6)和白介素–1β(interleukin–1sβ，IL-1β)水平，Real-time PCR法测定肺组织白介素–1β(interleukin–1β，IL-1β)，IL–6 mRNA表达水平。
　　结果：野生型PQ组小鼠PQ染毒6小时血清IL-6水平和肺组织IL-6 mRNA水平即明显升高，第24小时和第3天继续升高，各时间点IL-6水平都明显高于NS组(P<0.01)；Toll4-/-PQ组小鼠PQ染毒6小时、24小时、3天血清和肺组织IL-6水平均较野生型小鼠低，有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，Toll4-/-PQ组小鼠各时间点血清 IL-6水平高于 NS组（P<0.01），而肺组织第6小时、24小时IL-6水平与NS组相比差异无统计学意义(P>0.05)，第3天肺组织IL-6水平高于NS组（P<0.05）。野生型PQ组小鼠PQ染毒后肺血清及肺组织6小时、24小时、3天IL-1β水平持续升高，各时间点 IL-1β水平都高于 NS组(P<0.01)。Toll4-/-PQ组小鼠PQ染毒后第3天血清IL-1β水平较野生组小鼠明显降低，而 Toll4-/-PQ组小鼠各时点肺组织IL-1βmRNA水平与野生型小鼠相比无明显差异（p>0.05)。野生型PQ组小鼠至第3天时，肺泡腔塌陷、闭塞，肺泡间隔内大量红细胞及炎性细胞浸润；出现明显的肝血窦扩张淤血，肝细胞呈水样变性，有点片状坏死；肾小球炎性细胞侵润及纤维素渗出明显，部分肾小管细胞出现坏死。Toll4-/-PQ组小鼠染毒第3天肺泡间隔内大量红细胞及炎性细胞浸润，肺泡结构基本完整；肝细胞呈水样变性，有点状坏死；部分肾小球炎性细胞侵润及肾小管细胞坏死，肝肾基本结构正常。
　　结论：TLR4基因敲除小鼠可以减少急性百草枯中毒后部分炎性因子血清 IL–6、IL–1β的释放，并且肝、肾、肺组织的损害较野生型小鼠明显减轻，延缓PQ导致的急性多脏器功能损伤的病理进程。
　　第三部分高迁移率蛋白在小鼠急性百草枯中毒致急性肺损伤中的表达研究
　　目的：本实验将在百草枯致小鼠急性多脏器功能损伤的模型上研究炎性因子高迁移率蛋白在血清中的含量变化和肺组织表达情况。
　　方法：野生型C57BL小鼠随机分为空白对照（NS）组，百草枯处理组，NS对照组给予生理盐水60mg/kg腹腔注射，百草枯组给予百草枯60mg/kg腹腔注射。染毒后6h，24h，3d利用免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)染色方法观察小鼠肝肾肺组织病理改变，酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清中高迁移率蛋白-1(high-mobility group box1，HMGB1)的含量，R-T PCR法测定肺组织高迁移率蛋白mRNA表达情况。
　　结果：与生理盐水组小鼠比较，百草枯染毒组小鼠染毒后6小时血清血清HMGB1水平即出现较明显的升高(P<0.05)，第24小时和第3天继续升高，各时间点HMGB1水平都明显高于NS对照组(P<0.05)，NS对照组、PQ6h、PQ24h以及PQ3d各组间的血清HMGB1水平有明显差异，统计学意义显著(P<0.05)。百草枯染毒后6小时即有肺组织HMGB1-mRNA表达升高，第24小时肺组织HMGB1-mRNA表达明显增强，至染毒后第3天HMGB1-mRNA表达继续增强。百草枯染毒组小鼠染毒后第24小时，肺泡上皮细胞和肺间质炎性细胞核 HMGB1-表达呈强阳性，可见部分细胞胞浆、胞外呈阳性，肺泡结构仍保持较好的完整性；第3天肺泡结构破坏、塌陷，上皮细胞和肺炎性细胞核HMGB1-表达呈强阳性，胞浆、胞外亦有HMGB-1蛋白较高表达。
　　结论：小鼠急性百草枯中毒后导致炎性因子HMGB1释放增加，随着小鼠肺损伤病理改变加重，其血清含量及肺组织表达也愈加明显升高。

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前言

第一部分 百草枯中毒致多脏器功能损伤小鼠模型的建立

前言

1.1实验材料与方法

1.2实验结果

1.3 讨论

第二部分 Toll样受体4在百草枯致小鼠急性多脏器功能损伤的作用

前言

2.1主要仪器和试剂

2.2实验材料

2.3实验方法

2.4 统计学方法

2.5 结果

2.6 讨论

第三部分 高迁移率蛋白在小鼠急性百草枯中毒致急性肺损伤中的表达研究

前言

3.1材料和方法

3.2 统计学方法

3.3结果

3.4讨论

结论

参考文献

附录1:炎性小体依赖的高迁移率族蛋白1释放与脓毒症

附录2:NLRP3炎性小体活化研究

致谢

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