巨噬细胞活化在糖尿病创面愈合中的作用及机制研究

摘要

目的：研究巨噬细胞活化的两种亚型即经典型活化的巨噬细胞(caM)和替代性活化的巨噬细胞(aaM)在糖尿病创面愈合中的作用并初步探讨其机制。
　　方法：(1)STZ诱导成年雄性SD大鼠糖尿病模型背部制作全层缺损伤模型,用薄膜描绘法观察糖尿病组和对照组的各时相点创面愈合速率差异;
　　(2)免疫组化观察创面愈合时程中巨噬细胞数目的变化。免疫荧光双标法证实创面组织中是否存在两种活化类型的巨噬细胞及其阳性率;
　　(3)Western blot检测糖尿病组和对照组创面愈合过程中cam和aaM的标记物的水平变化趋势及两组之间的差异程度;
　　(4)Real-time PCR定量检测糖尿病组和对照组创面愈合过程中经典型巨噬细胞活化和替代性巨噬细胞活化相应的上游Th1/Th2诱导因子水平变化趋势及两组之间的差异程度;
　　(5)ELISA检测糖尿病组和对照组创面愈合过程中caM和aaM相应的炎症状态指标IL-10/IL-12比值的趋势及两组之间的差异程度;
　　(6)将THP1刺激后与HUVEC共培养,Western-blot观察经典型活化的巨噬细胞和替代性活化的巨噬细胞对HUVEC血管化的影响及高糖环境对巨噬细胞活化及HUVEC血管化的改变。
　　结果：(1)创面面积的动态观察结果表明,相比糖尿病组,对照组的SD大鼠背部创面愈合较快;
　　(2)免疫组化表明糖尿病创面组织中巨噬细胞浸润存在“慢进慢出”现象。激光共聚焦免疫荧光双标法显示正常创面愈合过程中caM主要集中在炎症期而aaM主要出现在修复增殖期。
　　(3)Western-blot表明糖尿病组和对照组创面愈合过程中caM和aaM的标记物(iNOS和Arg-1)的表达水平存在差异,其中糖尿病组中iNOS表达量在炎症期较低而Arg-1表达量在后期明显增高;
　　(4)Real-time PCR定量结果表明糖尿病组和对照组创面愈合过程中Th1/Th2诱导因子表达量与iNOS/Arg-1表达量有相关性;然而EUSA结果提示和体外实验不同,IL-10/IL-12比值和两组创面愈合过程中caM和aaM出现时相及趋势并不一致;
　　(5)Western-blot检测表明高糖可促进caM抑制aaM,同时caM抑制血管化而aaM促进血管化。
　　结论：caM和aaM存在于大鼠背部皮肤全层缺损创面愈合过程中,并且caM和aaM极其上游诱导因子和创面修复进程趋势一致。糖尿病创面中caM和aaM及其上游诱导因子异常,这可能是糖尿病创面难愈的一个重要原因。