β-内酰胺酰化酶自剪切机制及其突变株的构象变化

摘要

头孢菌素酰化酶(CA)和青霉素G酰化酶(PGA)可用于生产重要的制药中间体，具有极高的应用价值。这两个β内酰胺酰化酶同属于N端亲核(Ntn)水解酶超家族，拥有一个Ntn活性中心以及一个特征性的αββα核心结构区。早期的研究已提出了这类酶水解底物的分子机制:即由β亚基N端的Ntn活性中心Serβ1的侧链羟基负责亲核进攻，同时它的α氨基作为广义碱参与质子传递。此外还发现这两个酶还需两步自剪切成熟过程，并释放出一条前体肽。第一步自剪切的机理较为明确，然而第二步自剪切的机制尚有争论。
　　本研究首先针对CA的第二步自剪切机制展开研究，通过高分辨质谱分析慢剪切突变、切点移动突变和前体肽缩短突变，确认了CA的第二步剪切位点为Glu159-Gly160，并且Glu是重要的识别位点而Gly的短侧链能减少空间位阻。通过分析自剪切的一级反应动力学，第二步剪切反应与底物水解反应的相似性以及新发现的酰化肽酶活性和外切肽酶活性，提出了分子内Ntn反应理论，即第二步自剪切反应是在一个酶分子内由其自身的Ntn活性中心Serβ1进行催化的，解决了存在已久的关于这步自剪切反应机制的争论。同时，结合前体肽缩短突变的蛋白仍可进行自剪切的现象，表明第二步自剪切切点可以通过构象变化跨越22(A)的距离与Ntn活性中心接近并完成催化，进一步支持了分子内Ntn反应机制，并揭示了该酶动态催化过程。
　　对前体肽缩短且活性中心灭活(Sβ1A)的突变0aaS1A、2aaS1A以及4aaS1A的晶体学研究表明，突变后的结构存在较大的势能变化，足以克服水解反应和第二步自剪切反应的活化能能垒，说明了酶的构象变化对催化反应有重要贡献。
　　对CA和PGA及突变蛋白的溴代化合物标记研究表明，溴乙酰-7-氨基头孢烷酸(BAc-7-ACA)、溴丙酰-7-氨基头孢烷酸(BPr-7-ACA)及溴乙酰-丙氨酰-脯氨酸(BAc-AP)可亲和标记CA，而BAc-7-ACA，BPr-7-ACA和溴乙酰-6-氨基青霉烷酸(BAc-6-APA)可亲和标记PGA。这些溴代母核类似物的亲和标记过程反映了底物母核部分与酶的相互作用，而与底物侧链类似物苯甲基磺酰氟(PMSF)的亲和标记作用不同。但两类抑制剂都标记在了CA和PGA的Ntn活性中心Serβ1的侧链羟基上，因此支持了关于Ntn反应机制的经典理论。同时发现了两个αββα核心结构区中的突变Sβ3M与Aβ5M对CA的酶活产生了影响，这些突变离底物结合区及活性中心都较远，这种影响反映了αββα核心结构区对Ntn反应的重要性，解释了其进化上的保守性。
　　通过以上对CA和PGA的自剪切反应、底物水解反应以及化学亲和标记反应的研究，不仅解决了基本的分子催化机制问题，同时为高分子量的酶在结构与功能领域中重要的动态催化理论提供了部分实验支持，为更深入地理解酶催化反应的全过程提供了基础。同时头孢菌素酰化酶作为生产头孢菌素类抗生素重要中间体的工业用酶，提高其对天然产物头孢菌素C的水解活性对其应用有重要价值，本研究主要关注酶催化的理论研究，以此为基础也更有利于今后酶改造的研究工作。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 青霉素和头孢菌素

1．1．1 β-内酰胺类抗生素

1．1．2 青霉素与头孢菌素的历史背量

1．1．3 青霉素和头孢菌素的天然合成途径

1．1．4 人工半合成β-内酰胺类抗生素及重要的合成中间体

1．2 N-端亲核水解酶超家族

1．2．1 N-端亲核水解酶超家族的特征

1．2．2 Ntm水解酶的催化机制

1．3 头孢菌素酰化酶

1．3．1 头孢菌素酰化酶的来源，性质及分类

1．3．2 头孢菌素酰化酶翻译后加工过程

1．4 青霉素G酰化酶

1．5 头孢菌素酰化酶的自剪切成熟机制

1．5．1 第一步自剪切机制

1．5．2 第二步自剪切机制

1．6 酶的动态催化理论

1．7 本章小结

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 质粒

2．1．3 生化试剂

2．1．4 培养基及部分缓冲液

2．2 实验方法

2．2．1 大肠杆菌质粒质粒DNA的提取

2．2．2 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取及检测(快检)

2．2．3 DNA琼脂糖凝胶电泳

2．2．4 DNA酶切、酶连、PCR反应

2．2．5 DNA片段的回收

2．2．6 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．2．7 质粒DNA对大肠杆菌感受态细胞的转化

2．2．8 定点突变

2．2．9 蛋白表达与纯化

2．2．10 头孢菌素酰化酶及其突变体的SDS-PAGE分析

2．2．11 底物或标记物的化学合成

2．2．12 酶促反应动力学

2．2．13 ESI-Q-TOF分析生物大分子蛋白质的分子量

2．2．14 基于高分辨质谱Q-TOF LC／MS的肽谱分析

2．2．15 头孢菌素酰化酶前体肽缩短突变的结晶与解析

第三章 头孢菌素酰化酶第二步自剪切过程机理研究及酰化肽酶活性

3．1 头孢菌素酰化酶第二步剪切位点的确定

3．2 Glu159侧链是第二步剪切的识别位点

3．3 缩短前体肽突变

3．4 第二步自剪切的动力学分析

3．5 头孢菌素酰化酶的酰化肽酶活性

3．6 头孢菌素酰化酶的外切肽酶活性可以直接水解多肽N端的Glu

3．7 特异性结合与共价结合对第二步剪切的贡献

3．8 两个点突变Sβ1C和E159Q的第二步剪切重新鉴定

3．9 第二步剪切位点附近活性基团的分析

3．10 小结与讨论

第四章 头孢菌素酰化酶前体肽缩短突变的晶体学研究

4．1 前体肽缩短的前体突变蛋白

4．2 蛋白晶体的获得

4．3 突变蛋白与野生型蛋白的结构比较

4．4 通过分子动力学模拟算法比较突变蛋白与野生型蛋白的结构势能

4．5 头孢菌素酰化酶自剪切和底物水解的活化自由能与酶结构势能差的比较

4．6 小结与讨论

第五章 溴代底物母核类似物亲和标记头孢菌素酰化酶和青霉素G酰化酶

5．1 溴乙酰-7-氨基头孢烷酸(BAc-7-ACA)亲和标记头孢菌素酰化酶β亚基

5．2 BAc-7-ACA的标记位点是Ntn活性中心Serβ1的侧链羟基

5．3 BAc-7-ACA的标记CA的Ntn活性中心突变蛋白Sβ1C-CA

5．4 BAc-7-ACA是一个底物母核(7-ACA)类似物抑制剂

5．5 BAc-7-ACA标记PGA的Ntn活性中心Serβ1侧链羟基

5．6 关于PGA的烷基化标记和底物水解反应之间的相关性分析

5．7 另一个母核类似物BAc-AP的亲和标记反应

5．8 一系列Met的替换突变揭示了保守的αββα核心结构的重要性

5．9 小结与讨论

第六章 总结与展望

6．1 工作总结与创新点

6．2 进一步研究展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的论文