深海环境中未培养古菌多样性和代谢途径分析的研究

摘要

甲烷是大气中含量最为丰富的碳氢化合物,同时也是重要的温室气体之一。海洋中厌氧甲烷氧化(AOM)主要由ANME(the anaerobic methanotrophic archaea)介导,目前还未获得ANME的纯培养,其相关代谢途径还存在很多的未知。通过对Cadiz海湾泥火山样品进行高压厌氧流动富集培养,成功获得 ANME-2a的富集物。本研究通过对ANME-2a富集物构建fosmid文库,然后利用古菌16S rRNA和AOM代谢途径中的关键功能基因进行筛选。对筛选得到的38个目的fosmid双酶切后,从中挑取24个进行测序和分析,进而为富集物中古菌的代谢途径研究提供指导。通过fosmid中AOM关键基因与ANME-2a的单细胞团基因组中相应数据的比对及进化树构建,发现了唯一一个MBGD类群来源的fosmid克隆6A10,有19个fosmid来源于ANME-2a类群。对MBGD类群来源的的片段6A10进行ORF预测及注释,发现该片段包含嘌呤代谢、嘧啶代谢、糖代谢及异戊烯基代谢等功能基因。在ANME-2a类群来源的fosmid片段中,重点关注甲烷代谢相关的功能基因,并与ANME-1和其它甲烷产生菌中对应的基因进行比较和进化分析。结果发现 ANME-2a的对应的功能酶来源于Methanosarcinales目,而缺乏mer基因的ANME-1则与其亲缘关系较远。同时,我们首次从ANME-2a的基因组中找到两个mer基因:mer1和mer2,其中mer1属于Methanosarcinales目,mer2与mtr基因连锁,在进化树上形成单独的一支,这两个蛋白的生理和功能特性还有待进一步的研究。
　　深海热液口由于剧烈的温度(可达到400℃以上)、pH和化学梯度,成为地球生命起源和演化研究的焦点,海底热液口生命系统为人类提供了一个探索深部生命及生命起源和进化的窗口。本硕士论文的另一个研究内容是对瓜伊马斯深海热液口高温环境下沉积物和烟囱样品中古菌多样性的研究。采用实时荧光定量PCR首先对样品中古菌进行定量,沉积物和烟囱中古菌分别达到1.47×109拷贝数/g和5.29×108拷贝数/g(湿重)。通过核糖体小亚基16S rRNA基因文库的构建,发现沉积物和烟囱样品中的古菌类群多数是嗜热和超嗜热微生物,但两个样品中的古菌群落组成差异很大:沉积物以泉古菌门为主,优势菌群为 Miscellaneous Crenarchaeota Group( MCG)和Hot Water Crenarchaeota GroupⅠ(HWCGⅠ);烟囱样品则主要是广古菌门类群,其中以Thermococcales, Marine Benthic Group D(MBGD)和Deep Hydrothermal Vent Euryarchaeota(DHVE)为主。在沉积物样品中发现了一个新的MCG类群,命名为MCG-H,可能是MCG的高温独特类群。研究揭示,在瓜伊马斯深海热液口烟囱和沉积物中都包含有丰富的古菌类群,其中包括未被发现的新类群。对瓜伊马斯深海热液口古菌分布和多样性的研究将为进一步深入的古菌生理功能和演化的研究提供基础。

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第一章 前言

1.1深海微生物研究进展

1.2深海微生物生态

1.3微生物分子生态研究方法

1.4本研究的目的、思路和意义

第二章 材料与方法

2.1样品和实验材料

2.2基本方法

第三章 泥火山富集物宏基因组文库构建及微生物的代谢途径分析的研究

3.1样品采集与富集

3.2 Fosmid文库构建

3.3 Fosmid文库筛选与测序

3.4 MBGD片段6A10的分析

3.5 ANME-2a类群fosmid分析

3.6讨论

第四章 瓜伊马斯深海热液口古菌多样性研究

4.1样品采集位点

4.2古菌的定量

4.3古菌16S rRNA基因文库分析

4.4古菌16S rRNA基因多样性

4.5讨论

第五章 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文