基于人蛋白质组芯片的新O-GlcNAc糖基转移酶相互作用蛋白及底物发现研究

摘要

O-GlcNAc糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰形式,参与了许多重要的生物学过程。O-GlcNAc糖基化的异常与多种重要疾病的发生发展密切相关。目前已鉴定的O-GlcNAc糖基化的蛋白有1000多种,但是在人细胞中催化O-GlcNAc糖基化反应的却只有β-N-acetylglucosaminyl Transferase(OGT)一种酶(三种结构,分别为ncOGT, mOGT, sOGT),底物数目与酶数目之间存在如此大的反差,这里面的一个重要问题是一个单一的酶是如何有效地修饰如此众多功能各异的底物蛋白质的?有观点认为 OGT通过与不同的蛋白辅助因子结合形成具有底物特异性全酶来实现特异性的蛋白糖基化。但目前所报道的OGT相互作用蛋白只有三十多种,且全部为ncOGT的相互作用蛋白,数量如此之少的OGT相互作用蛋白质远不足以满足成千上万的O-GlcNAc糖基化底物,OGT的底物特异性到到底是如何决定的?同时由于O-GlcNAc糖基化在细胞内是一个高度动态的过程,与蛋白质磷酸化相似。在人体细胞中已发现的O-GlcNAc糖基化蛋白的数目远远小于已知的磷酸化的蛋白质数目,因此我们有理由相信,可能有更多的O-GlcNAc糖基化蛋白质有待发现。近年来新兴的蛋白质组芯片技术因其具有高通量、微型化、平行快速等优点为我们系统性的研究生物学问题提供了一个良好的平台。
　　本研究结合人蛋白质组芯片的优势,可以系统的筛查出人体内与ncOGT相互作用的蛋白和糖基化底物。最终我们从芯片上筛选出了29个与ncOGT相互作用的蛋白,将这29个蛋白进行一些生物信息学如PANTHER(Protein Analysis Through Evolutionary Relationships)等分类分析。生物信息学的结果分析显示这些蛋白参与多种生命活动,主要集中在高尔基内介导的膜泡转运和维生素的生物合成。接着从29个蛋白中选出6个具有重要意义的蛋白进行体内Co-IP和体外动力学分析,结果显示PSAT1和HAAO与ncOGT之间存在着明显的相互作用。同时我们也检测到PSAT1和HAAO在体内均是被O-GlcNAc糖基化的。对ncOGT, sOGT进行了酶活实验的测定,基于芯片的高通量性,用OGT小肽底物点制成小肽芯片,然后进行芯片酶活反应。发现在体外条件下只有sOGT有酶活,随后我们对sOGT的酶活反应条件进行了一些列的优化,最后确定出了sOGT体外反应的最佳体系。在今后的工作中我们可以考虑将sOGT的酶活反应转移到人的全基因组蛋白芯片上,从而系统的筛查人体内 O-GlcNAc糖基化修饰的蛋白,结合前一部分所筛查的OGT相互作用蛋白,或许能够为我们解开O-GlcNAc糖基化的机制提供依据。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

中英文简写对照表

第一章 绪论

1 O-GlcNAc糖基化概述

2 蛋白质芯片技术

3 Co-IP

4 Fortebio分子相互作用工作站

5 本文的主要工作

第二章 实验材料

1. 试剂与耗材

2. 仪器

第三章 基于人蛋白质组芯片的新O-GlcNAc糖基转移酶相互作用蛋白发现研究

1． 概述

2. 实验流程及方法

3. 结果

4. 本章小结

第四章 O-GlcNAc糖基转移酶底物酶活反应的条件优化

1. 概述

2. 酶活分析实验流程及方法

3. 结果

4本章小结

第五章 总结和展望

1 总结

2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间的文章